Live beeldvorming en kwantificering van virale infectie bij K18 hACE2 transgene muizen met reporter-expressing recombinant SARS-CoV-2
Summary
Dit protocol beschrijft de dynamiek van virale infecties met behulp van luciferase- en fluorescentie-expresserende recombinant (r)SARS-CoV-2 en een in vivo beeldvormingssysteem (IVIS) in K18 hACE2 transgene muizen om de behoefte aan secundaire benaderingen te overwinnen die nodig zijn om SARS-CoV-2-infecties in vivo te bestuderen.
Abstract
De pandemie van de coronavirusziekte 2019 (COVID-19) is veroorzaakt door ernstig acuut respiratoir syndroom coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Tot op heden is SARS-CoV-2 verantwoordelijk voor meer dan 242 miljoen infecties en meer dan 4,9 miljoen doden wereldwijd. Net als andere virussen vereist het bestuderen van SARS-CoV-2 het gebruik van experimentele methoden om de aanwezigheid van virus in geïnfecteerde cellen en / of in diermodellen te detecteren. Om deze beperking te overwinnen, hebben we replicatie-competente recombinante (r) SARS-CoV-2 gegenereerd die bioluminescente (nanoluciferase, Nluc) of fluorescerende (Venus) eiwitten tot expressie brengt. Deze reporter-expressing rSARS-CoV-2 maken het mogelijk om virale infecties in vitro pt in vivo te volgen op basis van de expressie van Nluc- en Venus-reportergenen. Hier beschrijft de studie het gebruik van rSARS-CoV-2/Nluc en rSARS-CoV-2/Venus om SARS-CoV-2-infectie te detecteren en te volgen in het eerder beschreven K18 humane angiotensine-converterende enzym 2 (hACE2) transgene muismodel van infectie met behulp van in vivo beeldvormingssystemen (IVIS). Deze rSARS-CoV-2/Nluc en rSARS-CoV-2/Venus tonen rSARS-CoV-2/WT-achtige pathogeniciteit en virale replicatie in vivo. Belangrijk is dat de expressie van Nluc en Venus ons in staat stelt om virale infecties in vivo en ex vivo, bij geïnfecteerde muizen, direct te volgen. Deze rSARS-CoV-2/Nluc en rSARS-CoV-2/Venus vormen een uitstekende optie om de biologie van SARS-CoV-2 in vivo te bestuderen, virale infectie en bijbehorende COVID-19-ziekte te begrijpen en effectieve profylactische en/of therapeutische behandelingen te identificeren om SARS-CoV-2-infectie te bestrijden.
Introduction
Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) is een omhuld, positief,enkelstrengs RNA-virus dat behoort tot de Betacoronavirus-afstamming in de Coronaviridae-familie 1. Deze virale familie is onderverdeeld in Alpha-, Beta-, Gamma- en Delta-coronavirus1. Alfa- en Betacoronavirussen infecteren voornamelijk zoogdieren, terwijl Gamma- en Deltacoronavirus bijna uitsluitend vogels infecteren2. Tot op heden hebben zeven coronavirussen (CoV) soortenbarrières overschreden en zijn ze naar voren gekomen als menselijke coronavirussen (HCoV): twee alfa-CoV’s (HCoV-229E en HCoV-NL63) en vijf bèta-CoV’s (HCoV-OC43, HCoV-HKU1, SARS-CoV, Midden-Oosten respiratoir syndroom coronavirus [MERS-CoV] en SARS-CoV-2)3,4,5,6. SARS-CoV, MERS-CoV en SARS-CoV-2 zijn hoogpathogeen en veroorzaken ernstige infectie van de onderste luchtwegen7. Voorafgaand aan de opkomst van SARS-CoV-2 waren er twee epidemische uitbraken veroorzaakt door CoV’s: SARS-CoV in Guangdong Providence, China, van 2002-2003, met een sterftecijfer (CFR) van ongeveer 9,7%; en MERS-CoV in het Midden-Oosten van 2012 tot heden, met een CFR van ongeveer 34%7,8. SARS-CoV-2 heeft een totale CFR tussen 3,4%-49%, waarbij onderliggende aandoeningen bijdragen aan een hogere CFR 8,9. Sinds de ontdekking in december 2019 is SARS-CoV-2 in Wuhan, China, verantwoordelijk voor meer dan 242 miljoen menselijke infecties en meer dan 4,9 miljoen menselijke sterfgevallen wereldwijd 7,10,11,12. Met name sinds eind 2020 hebben nieuwe SARS-CoV-2-varianten van bezorgdheid (VoC) en varianten van belang (VoI) invloed gehad op viruskenmerken, waaronder transmissie en antigeniciteit 9,13, en de algemene richting van de COVID-19-pandemie. Voor de behandeling van SARS-CoV-2-infecties is er momenteel slechts één Verenigde Staten (VS) Food and Drug Administration (FDA) therapeutisch antiviraal (remdesivir) en één Emergency Use Authorization (EUA) geneesmiddel (baricitinib, toe te dienen in combinatie met remdesivir)14. Er zijn ook 6 goedgekeurde EUA monoklonale antilichamen: REGEN-COV (casirivimab en imdevimab, samen toegediend), sotrovimab, tocilizumab en bamlanivimab en etesevimab samen toegediend 15,16,17,18,19. Er is momenteel slechts één door de FDA goedgekeurd profylactisch vaccin, Pfizer-BioNTech, en twee andere profylactische vaccins (Moderna en Janssen) zijn EUA goedgekeurd 20,21,22,23,24. Met de ongecontroleerde infectiegraad en de opkomst van VoC en VoI vormt SARS-CoV-2 echter nog steeds een bedreiging voor de menselijke gezondheid. Daarom zijn nieuwe benaderingen dringend nodig om efficiënte profylactica en therapeutica te identificeren om SARS-CoV-2-infectie en de nog steeds lopende COVID-19-pandemie onder controle te houden.
Het bestuderen van SARS-CoV-2 vereist moeizame technieken en secundaire benaderingen om de aanwezigheid van het virus in geïnfecteerde cellen en / of gevalideerde diermodellen van infectie te identificeren. Het gebruik van omgekeerde genetica heeft het mogelijk gemaakt om recombinante virussen te genereren om belangrijke vragen in de biologie van virale infecties te beantwoorden. Omgekeerde geneticatechnieken hebben bijvoorbeeld middelen geboden om de mechanismen van virale infectie, pathogenese en ziekte te ontdekken en te begrijpen. Evenzo hebben omgekeerde geneticabenaderingen de weg vrijgemaakt om recombinante virussen te manipuleren die geen virale eiwitten hebben om hun bijdrage aan virale pathogenese te begrijpen. Daarnaast zijn omgekeerde geneticatechnieken gebruikt om recombinante virussen te genereren die reportergenen tot expressie brengen voor in vitro pt in vivo toepassingen, waaronder het identificeren van profylactische en / of therapeutische benaderingen voor de behandeling van virale infecties. Fluorescerende en bioluminescente eiwitten zijn de meest gebruikte reportergenen vanwege hun gevoeligheid, stabiliteit en eenvoudige detectie op basis van de verbetering van nieuwe technologieën25,26. In vitro is aangetoond dat fluorescerende eiwitten dienen als een betere optie voor de lokalisatie van virussen in geïnfecteerde cellen, terwijl luciferasen handiger zijn voor kwantificeringsstudies 27,28,29. In vivo hebben luciferasen de voorkeur boven fluorescerende eiwitten voor beeldvorming van hele dieren, terwijl fluorescerende eiwitten de voorkeur hebben voor de identificatie van geïnfecteerde cellen of ex vivo beeldvorming 30,31,32. Het gebruik van reporter-expresserende recombinante virussen heeft gediend als een krachtig hulpmiddel voor de studie van virussen in veel families, waaronder flavivirussen, enterovirussen, alfavirussen, lentivirussen, arenavirussen en influenzavirussen 28,33,34,35,36.
Om de behoefte aan secundaire benaderingen voor het bestuderen van SARS-CoV-2 en het karakteriseren van real-time SARS-CoV-2-infectie in vivo te overwinnen, hebben we replicatie-competente recombinant (r) SARS-CoV-2 gegenereerd die bioluminescente (nanoluciferase, Nluc) of fluorescerende (Venus) eiwitten tot expressie brengt met behulp van onze eerder beschreven bacteriële kunstmatige chromosomen (BAC) -gebaseerde omgekeerde genetica, die als een enkele kopie in E. coli worden onderhouden om de toxiciteit van virussequenties tijdens de verspreiding ervan in bacteriën tot een minimum te beperken 37,38. Met name rSARS-CoV-2/Nluc en rSARS-CoV-2/Venus vertoonden rSARS-CoV-2/WT-achtige pathogeniciteit in vivo. Het hoge niveau van Venus-expressie van rSARS-CoV-2 / Venus maakte het mogelijk om virale infectie in de longen van geïnfecteerde K18 hACE2 transgene muizen te detecteren met behulp van een in vivo beeldvormingssysteem (IVIS)39. De niveaus van Venus-expressie correleerden goed met virale titers gedetecteerd in de longen, wat de haalbaarheid aantoont van het gebruik van Venus-expressie als een geldig surrogaat van SARS-CoV-2-infectie. Met behulp van rSARS-CoV-2/Nluc konden we de dynamiek van virale infecties in realtime volgen en SARS-CoV-2-infectie in vivo longitudinaal beoordelen met dezelfde IVIS-benadering in K18 hACE2 transgene muizen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol toont de haalbaarheid aan van het gebruik van deze rSARS-CoV-2-expressie van reportergenen om virale infecties in vivo te volgen. Beide reporter-expresserende recombinante virussen bieden een uitstekend hulpmiddel voor het bestuderen van SARS-CoV-2-infecties in vivo. De beschreven ex vivo (rSARS-CoV-2/Venus) en in vivo (rSARS-CoV-2/Nluc) beeldvormingssystemen vormen een uitstekende optie om de dynamiek van SARS-CoV-2-infectie, virale pathogenese te begrijpen en geïnfectee…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen de leden van ons instituut (Texas Biomedical Research Institute) bedanken voor hun inspanningen om onze faciliteiten volledig operationeel en veilig te houden tijdens de COVID-19-pandemie. We willen ook onze Institutional Biosafety Committee (IBC) en spell (IACUC) bedanken voor het herzien van onze protocollen op een tijdsefficiënte manier. We bedanken Dr. Thomas Moran van de Icahn School of Medicine op de berg Sinaï voor het verstrekken van het SARS-CoV cross-reactieve 1C7C7 nucleocapsid (N) eiwit monoklonale antilichaam. SARS-CoV-2-onderzoek in het laboratorium van Martinez-Sobrido wordt momenteel ondersteund door de NIAID / NIH-subsidies RO1AI161363-01, RO1AI161175-01A1 en R43AI165089-01; het Ministerie van Defensie (DoD) verleent W81XWH2110095 en W81XWH2110103; het San Antonio Partnership for Precision Therapeutic; het Texas Biomedical Research Institute Forum; het Health Science Center van de Universiteit van Texas in San Antonio; de San Antonio Medical Foundation; en door het Center for Research on Influenza Pathogenesis and Transmission (CRIPT), een door NIAID gefinancierd Center of Excellence for Influenza Research and Response (CEIRR, contract # 75N93021C00014).
Materials
| 0.5% Triton X-100 | J.T.Baker | X198-07 | Store at room temperature (RT) |
| 1% DEAE-Dextran | MP Biomedicals | 195133 | |
| 10% Formalin solution, neutral buffered | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Agar | Oxoid | LP0028 | |
| 24-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 662160 | |
| 5% Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S-5761 | |
| 6-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
| 96-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 655-180 | |
| African green monkey kidney epithelial cells (Vero E6) | ATCC | CRL-1586 | |
| Ami HT | Spectral Instruments Imaging | ||
| Aura Imaging Software 3.2.0 | Spectral Instruments Imaging | Image analysis software | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), 35% | Sigma-Aldrich | A9647 | Store at 4 °C |
| Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Corning Cellgro | 15-013-CV | Store at 4 °C |
| Anesthesia gas machine | Veterinary Anesthesia Systems, Inc. | VAS 2001R | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-050 | Store at -20 °C |
| Four- to six-week-old female K18-hACE2 transgenic mice | The Jackson Laboratory | 34860 | |
| Graphpad Prism Version 9.1.0 | GraphPad | ||
| Isoflurane | Baxter | 1001936040 | Store at RT |
| MARS Data Analysis Software | BMG LABTECH | ||
| MB10 tablets | QUIP Laboratories | MBTAB1.5 | Store at RT |
| Nano-Glo Luciferase Assay Reagent | Promega | N1110 | This reagent is used to measure Nluc activity. Store at -20 °C |
| Nunc MicroWell 96-Well Microplates | ThermoFisher Scientific | 269620 | |
| Nunc MicroWell 96-Well Microplates | ThermoFisher Scientific | 269620 | |
| Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x | Corning | 30-009-CI | Store at -20 °C |
| PHERAstar FSX | BMG LABTECH | PHERAstar FSX | |
| Precelleys Evolution homogenizer | Bertin Instruments | P000062-PEVO0-A | |
| Soft tissue homogenizing CK14 – 7 mL | Bertin Instruments | P000940-LYSK0-A | |
| T75 EasYFlask | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| VECTASTAIN ABC-HRP Kit, Peroxidase | Vector Laboratories | PK-4002 | ABC kit and DAB Peroxidase Substrate kit |
Referências
- V’Kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H., Thiel, V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 155-170 (2021).
- Pal, M., Berhanu, G., Desalegn, C., Kandi, V. Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2 (SARS-CoV-2): An update. Cureus. 12 (3), 7423 (2020).
- Su, S., et al. Epidemiology, genetic recombination, and pathogenesis of coronaviruses. Trends in Microbiology. 24 (6), 490-502 (2016).
- Cui, J., Li, F., Shi, Z. L. Origin and evolution of pathogenic coronaviruses. Nature Reviews Microbiology. 17 (3), 181-192 (2019).
- Lu, R., et al. Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding. Lancet. 395 (10224), 565-574 (2020).
- Evans, J. P., Liu, S. L. Role of host factors in SARS-CoV-2 entry. Journal of Biological Chemistry. 297 (1), 100847 (2021).
- Petersen, E., et al. Comparing SARS-CoV-2 with SARS-CoV and influenza pandemics. Lancet Infectious Diseases. 20 (9), 238-244 (2020).
- Alfaraj, S. H., et al. Clinical predictors of mortality of Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV) infection: A cohort study. Travel Medicine and Infectious Disease. 29, 48-50 (2019).
- Harvey, W. T., et al. SARS-CoV-2 variants, spike mutations and immune escape. Nature Reviews Microbiology. 19 (7), 409-424 (2021).
- Dong, E., Du, H., Gardner, L. An interactive web-based dashboard to track COVID-19 in real time. Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 533-534 (2020).
- Bar-On, Y. M., Flamholz, A., Phillips, R., Milo, R. ARS-CoV-2 (COVID-19) by the numbers. Elife. 9, 57309 (2020).
- Roussel, Y., et al. SARS-CoV-2: fear versus data. International Journal of Antimicrobial Agents. 55 (5), 105947 (2020).
- Scialo, F., et al. SARS-CoV-2: One year in the pandemic. What have we learned, the new vaccine era and the threat of SARS-CoV-2 variants. Biomedicines. 9 (6), 611 (2021).
- . Coronavirus (COVID-19) update: FDA authorizes additional monoclonal antibody for treatment of COVID-19 Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/coronavirus-covid-19-update-fda-authorizes-additional-monoclonal-antibody-treatment-covid-19 (2021)
- Dougan, M., et al. Bamlanivimab plus Etesevimab in Mild or Moderate Covid-19. New England Journal of Medicine. 385 (15), 1382-1392 (2021).
- Ledford, H. COVID antibody treatments show promise for preventing severe disease. Nature. 591 (7851), 513-514 (2021).
- Tuccori, M., et al. An overview of the preclinical discovery and development of bamlanivimab for the treatment of novel coronavirus infection (COVID-19): reasons for limited clinical use and lessons for the future. Expert Opinion on Drug Discovery. , 1-12 (2021).
- Phan, A. T., Gukasyan, J., Arabian, S., Wang, S., Neeki, M. M. Emergent inpatient administration of casirivimab and imdevimab antibody cocktail for the treatment of COVID-19 pneumonia. Cureus. 13 (5), 15280 (2021).
- O’Brien, M. P., et al. Subcutaneous REGEN-COV antibody combination in early SARS-CoV-2 infection. medRxiv. , (2021).
- Beigel, J. H., et al. Remdesivir for the treatment of Covid-19 – Final report. New England Journal of Medicine. 383 (19), 1813-1826 (2020).
- Li, L., et al. Effect of convalescent plasma therapy on time to clinical improvement in patients with severe and life-threatening COVID-19: A randomized clinical trial. Journal of the American Medical Association. 324 (5), 460-470 (2020).
- Polack, F. P., et al. Safety and efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 vaccine. New England Journal of Medicine. 383 (27), 2603-2615 (2020).
- Oliver, S. E., et al. The advisory committee on immunization practices’ interim recommendation for use of Pfizer-BioNTech COVID-19 vaccine – United States, December 2020. Morbidity and Mortality Weekly Report. 69 (50), 1922-1924 (2020).
- Oliver, S. E., et al. The advisory committee on immunization practices’ interim recommendation for use of Janssen COVID-19 vaccine – United States, February 2021. Morbidity and Mortality Weekly Report. 70 (9), 329-332 (2021).
- Zhao, H., et al. Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41210 (2005).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Nogales, A., et al. A novel fluorescent and bioluminescent bireporter Influenza A Virus to evaluate viral infections. Journal of Virology. 93 (10), 00032 (2019).
- Nogales, A., et al. Replication-competent fluorescent-expressing influenza B virus. Virus Research. 213, 69-81 (2016).
- Welsh, D. K., Noguchi, T. Cellular bioluminescence imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (8), (2012).
- Tran, V., Moser, L. A., Poole, D. S., Mehle, A. Highly sensitive real-time in vivo imaging of an influenza reporter virus reveals dynamics of replication and spread. Journal of Virology. 87 (24), 13321-13329 (2013).
- Schoggins, J. W., et al. Dengue reporter viruses reveal viral dynamics in interferon receptor-deficient mice and sensitivity to interferon effectors in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14610-14615 (2012).
- Luker, G. D., et al. Noninvasive bioluminescence imaging of herpes simplex virus type 1 infection and therapy in living mice. Journal of Virology. 76 (23), 12149-12161 (2002).
- Li, X., et al. Development of a rapid antiviral screening assay based on eGFP reporter virus of Mayaro virus. Antiviral Research. 168, 82-90 (2019).
- Kirui, J., Freed, E. O. Generation and validation of a highly sensitive bioluminescent HIV-1 reporter vector that simplifies measurement of virus release. Retrovirology. 17 (1), 12 (2020).
- Shang, B., et al. Development and characterization of a stable eGFP enterovirus 71 for antiviral screening. Antiviral Research. 97 (2), 198-205 (2013).
- Zou, G., Xu, H. Y., Qing, M., Wang, Q. Y., Shi, P. Y. Development and characterization of a stable luciferase dengue virus for high-throughput screening. Antiviral Research. 91 (1), 11-19 (2011).
- Ye, C., et al. Rescue of SARS-CoV-2 from a single bacterial artificial chromosome. mBio. 11 (5), 02168 (2020).
- Avila-Perez, G., Park, J. G., Nogales, A., Almazan, F., Martinez-Sobrido, L. Rescue of recombinant Zika virus from a bacterial artificial chromosome cDNA clone. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59537 (2019).
- Chiem, K., et al. A bifluorescent-based assay for the identification of neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 variants of concern in vitro and in vivo. Journal of Virology. , (2021).
- Committee for the update of the guide for the care and use of laboratory animals., Institute for laboratory animal research (U.S) & National Academies Press (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. 8th edn. National Research Council (US). , (2011).
- Ye, C., et al. Analysis of SARS-CoV-2 infection dynamic in vivo using reporter-expressing viruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), (2021).
