Überwachung der Darmsäuerung im erwachsenen Drosophila-Darm

Summary

Hier stellen wir ein standardisiertes Protokoll zur Überwachung der Darmsäuerung bei Drosophila melanogaster mit optimalem Output vor. Wir verwenden dieses Protokoll zuerst für das Monitoring der Darmversauerung bei Drosophila melanogaster und demonstrieren dann seine Verwendung bei Nicht-Modell-Drosophila-Spezies.

Abstract

Der Fruchtfliegenmitteldarm besteht aus mehreren Regionen, von denen jede aus Zellen besteht, die einzigartige physiologische Funktionen ausführen, die für das reibungslose Funktionieren des Darms erforderlich sind. Eine solche Region, die Kupferzellregion (CCR), ist im mittleren Mitteldarm lokalisiert und besteht zum Teil aus einer Gruppe von Zellen, die als Kupferzellen bekannt sind. Kupferzellen sind an der Magensäuresekretion beteiligt, einem evolutionär konservierten Prozess, dessen genaue Rolle kaum verstanden wird. Dieses Papier beschreibt Verbesserungen im aktuellen Protokoll, das zur Untersuchung der Übersäuerung des adulten Drosophila melanogaster-Darms verwendet wird, und zeigt, dass es bei anderen Fliegenarten angewendet werden kann. Insbesondere zeigt diese Arbeit, dass die Übersäuerung des Darms vom Ernährungszustand der Fliege abhängt und stellt ein Protokoll vor, das auf diesem neuen Befund basiert. Insgesamt zeigt dieses Protokoll die potenzielle Nützlichkeit der Untersuchung von Drosophila-Kupferzellen , um allgemeine Prinzipien aufzudecken, die den Mechanismen der Darmversauerung zugrunde liegen.

Introduction

Im Insektendarm teilen Kupferzellen zelluläre und funktionelle Ähnlichkeiten mit den säureproduzierenden Magenparietalzellen (auch bekannt als oxyntisch) des Säugetiermagens. Diese Gruppe von Zellen setzt Säure in das Darmlumen frei. Die Funktion der Säuresekretion und Anatomie ist evolutionär erhalten. Die Hauptbestandteile der entladenen Säure sind Salzsäure und Kaliumchlorid. Der chemische Mechanismus der Säurebildung in den Zellen hängt von der Carboanhydrase ab. Dieses Enzym erzeugt aus _CO2 und Wasser ein Bicarbonation, das ein Hydroxylion freisetzt, das dann durch eine Protonenpumpe im Austausch für Kalium in das Lumen abgegeben wird. Chlorid- und Kaliumionen werden über Leitfähigkeitskanäle in das Lumen transportiert, was zur Bildung von Salzsäure und Kaliumchlorid, dem Hauptbestandteil des Magensaftes^, führt1,2,3,4.

Obwohl die Mechanismen der Säurebildung gut verstanden sind, ist viel weniger über die physiologischen Mechanismen bekannt, die die Säuresekretion regulieren. Ziel der Entwicklung dieser Methode ist es, die zellulären Wege, die die Säurebildung und -sekretion koordinieren, besser abzugrenzen und die Rolle der Säure bei der Vermittlung der Darmphysiologie und Homöostase zu bestimmen. Die Begründung für die Entwicklung und Anwendung dieser Technik besteht darin, eine konsistente und zuverlässige Methode zur Untersuchung des Prozesses der Darmversauerung in Drosophila und Nicht-Modellorganismen bereitzustellen. Obwohl derzeit ein Standardprotokoll zur Bestimmung der Drosophila-Mitteldarmversauerung ^{existiert2,5,6} wurde eine signifikante Variabilität im Ausmaß der Versauerung bei Wildtypfliegen (WT) beobachtet, während dieses Protokoll zur Untersuchung der Kupferzellfunktion verwendet wurde. Um die Grundlage für diese beobachtete Variabilität zu verstehen und konsistente Ergebnisse zu erhalten, wurden mehrere Aspekte des Standardprotokolls wie unten beschrieben optimiert.

Protocol

HINWEIS: Die Standard-Laborlinie Oregon R wurde als WT-Steuerung verwendet. Alle Fliegen wurden auf Standard-Maismehl-Melasse-Medium (mit Melasse, Agar, Hefe, Maismehl, Tegosept, Propionsäure und Wasser) bei Raumtemperatur mit 12/12 h hell/dunkel zirkadianem Rhythmus aufgezogen. 1. Vorbereitung auf den Assay Sammeln Sie weibliche Fliegen (0-2 Tage alt, nicht jungfräulich) unter CO2-Anästhesie und lassen Sie sie sich mindestens 3 Tage vor den Experimente…

Representative Results

Wir hungerten Oregon R weibliche Fliegen für mehr als 20 h und fütterten sie dann mit BPB (2%) für ~ 12 h, wie zuvor beschrieben7,8,9,10,11. Bromphenolblau (BPB) ist ein pH-sensorischer Farbstoff. Es wechselt von Gelb bei pH 3,0 zu Blau bei pH 4,6 und höher. Nach der Darmdissektion wurde, wie bereits berichtet, festgestellt, dass einige Fliegen Säure prod…

Discussion

Ein kritischer Schritt in diesem Protokoll ist die richtige Dissektion des Darms, um die CCR für den Versauerungsphänotyp zu visualisieren. Die aus den Kupferzellen freigesetzte Säure ist auf das CCR beschränkt, wenn der Darm intakt ist. Während der Dissektion kann jedoch eine durch darmruptur verursachte Leckage zur Diffusion von Säure aus dem CCR führen und zu einem Darm führen, der fälschlicherweise als negativ für die Übersäuerung bewertet wird. Darüber hinaus verblasst die gelbe Farbe, die auf eine Ans?…

Materials

Bromophenol blue	Sigma-Aldrich		B0126
cellSens software	Olympus		Image aqusition (https://www.olympus-lifescience.com/en/software/cellsens)
D. simulans	Drosophila Species Stock Center at the University of California		Riverside California1 (https://www.drosophilaspecies.com/)
D. erecta	Drosophila Species Stock Center at the University of California		Dere cy1(https://www.drosophilaspecies.com/)
D. pseudoobscura	Drosophila Species Stock Center at the University of California		Eugene, Oregon(https://www.drosophilaspecies.com/)
D. mojavensis	Drosophila Species Stock Center at the University of California		Chocolate Mountains, California (https://www.drosophilaspecies.com/)
Forceps	Inox Biology		Catalog# 11252-20
Fuji	Fuji		Image processing (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html)
Glass slide	VWR		Catalog#16005-108
Kim wipes Tissue	Kimtech
Microscope and camera	Olympus SZ61 microscope equipped with an Olympus D-27 digital camera		Imaging
Oregon R	Bloomington Drosophila Stock		(https://bdsc.indiana.edu/ # 2376)
Petri dishes	Fisher Scientific		Catalog #FB0875713A
Phosphate-buffered Saline (PBS)	HyClone		Catalog # SH30258.01
Stereomicroscope	Olympus SZ51		Visual magnification