Yetişkin Drosophila Bağırsasında Bağırsak Asitleşmesini İzleme
Summary
Burada, Drosophila melanogaster’daki bağırsak asitleşmesini optimal çıkışla izlemek için standartlaştırılmış bir protokol sunuyoruz. Bu protokolü ilk olarak Drosophila melanogaster’da bağırsak asitleştirme izleme için kullanıyoruz ve daha sonra model olmayan Drosophila türlerinde kullanımını gösteriyoruz.
Abstract
Meyve sineği midgut, her biri bağırsakların düzgün çalışması için gerekli benzersiz fizyolojik işlevleri yerine getiren hücrelerden oluşan birden fazla bölgeden oluşur. Bu bölgelerden biri olan bakır hücre bölgesi (CCR), orta ortaguta lokalizedir ve kısmen bakır hücre olarak bilinen bir grup hücreden oluşur. Bakır hücreler, kesin rolü yetenemeyen evrimsel olarak korunmuş bir süreç olan mide asidi salgılanmasına dahil olur. Bu makale, yetişkin Drosophila melanogaster bağırsağın asitleştirilmesi için kullanılan mevcut protokoldeki gelişmeleri açıklar ve diğer sinek türlerinde kullanılabileceğini göstermektedir. Özellikle, bu makale bağırsak asitleşmesinin sineğin beslenme durumuna bağlı olduğunu göstermektedir ve bu yeni bulguya dayanan bir protokol sunun. Genel olarak, bu protokol, bağırsak asitleştirme mekanizmalarının altında yer alan genel ilkeleri ortaya çıkarmak için Drosophila bakır hücrelerini incelemenin potansiyel yararlılığını göstermektedir.
Introduction
Böcek bağırsasında, bakır hücreler memeli midesinin asit üreten mide parietal hücreleri (oksintik olarak da bilinir) ile hücresel ve fonksiyonel benzerlikleri paylaşır. Bu hücre grubu bağırsak lümenine asit salgılar. Asit salgısı ve anatomisinin işlevi evrimsel olarak korunur. Boşaltılan asidin ana bileşenleri hidroklorik asit ve potasyum klorürdür. Hücrelerde asit oluşumunun kimyasal mekanizması karbonik anhidre bağlıdır. Bu enzim, CO2 ve sudan bikarbonat iyon üretir, bu da daha sonra potasyum karşılığında bir proton pompası aracılığıyla lümene boşaltılan bir hidroksil iyonunu serbest eder. Klorür ve potasyum iyonları iletkenlik kanalları ile lümene taşınır ve bu da mide suyunun ana bileşeni olan hidroklorik asit ve potasyum klorürün oluşumuna neden olan 1,2,3,4.
Asit oluşum mekanizmaları iyi anlaşılsa da asit salgısını düzenleyen fizyolojik mekanizmalar hakkında çok daha az şey bilinmektedir. Bu yöntemi geliştirmenin amacı, asit oluşumunu ve salgısını koordine eden hücresel yolların daha iyi belirlenmesine yardımcı olmak ve asidin bağırsak fizyolojisi ve homeostazda aracılık etmedeki rolünü belirlemektir. Bu tekniğin geliştirilmesinin ve kullanılmasının arkasındaki mantık, Drosophila ve model olmayan organizmalarda bağırsak asitleşme sürecini incelemek için tutarlı ve güvenilir bir yöntem sağlamaktır. Drosophila midgut asitleşmesini belirlemek için standart bir protokol şu anda 2,5,6 olmasına rağmen, bakır hücre fonksiyonunu incelemek için bu protokolü kullanırken vahşi tip (WT) sineklerde asitleşme boyutunda önemli değişkenlik gözlenmiştir. Gözlemlenen bu değişkenliğin temelini anlamak ve tutarlı sonuçlar elde etmek için, standart protokolün çeşitli yönleri aşağıda açıklandığı gibi optimize edilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokolde kritik bir adım, asitleşme fenotipi için CCR’yi görselleştirmek için bağırsakların uygun şekilde diseksiyonudur. Bakır hücrelerden salınan asit, bağırsak sağlam olduğunda CCR ile sınırlıdır. Bununla birlikte, diseksiyon sırasında, bağırsağın yırtılmasından kaynaklanan sızıntı, CCR’den asitin yayılmasına neden olabilir ve yanlışlıkla asitleşme için negatif olarak puanlanan bir bağırsakla sonuçlanabilir. Ek olarak, asitleşmenin sarı rengi diseksiyondan sonra 5-10 d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, yazarın laboratuvarındaki çalışmalara verilen desteğin, UT Southwestern Tıp Merkezi’ndeki Çocuk Araştırma Enstitüsü’nden HHMI Fakülte Akademik Ödülü ve başlangıç fonları tarafından sağlandığını kabul eder.
Materials
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| cellSens software | Olympus | Image aqusition (https://www.olympus-lifescience.com/en/software/cellsens) | |
| D. simulans | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Riverside California1 (https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. erecta | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Dere cy1(https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. pseudoobscura | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Eugene, Oregon(https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. mojavensis | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Chocolate Mountains, California (https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| Forceps | Inox Biology | Catalog# 11252-20 | |
| Fuji | Fuji | Image processing (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html) | |
| Glass slide | VWR | Catalog#16005-108 | |
| Kim wipes Tissue | Kimtech | ||
| Microscope and camera | Olympus SZ61 microscope equipped with an Olympus D-27 digital camera | Imaging | |
| Oregon R | Bloomington Drosophila Stock | (https://bdsc.indiana.edu/ # 2376) | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | Catalog #FB0875713A | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | HyClone | Catalog # SH30258.01 | |
| Stereomicroscope | Olympus SZ51 | Visual magnification |
Referências
- Hollander, F. The composition and mechanism of formation of gastric acid secretion. Science. 110 (2846), 57-63 (1949).
- Forte, J. G., Zhu, L. Apical recycling of the gastric parietal cell H, K-ATPase. Annual Review of Physiology. 72, 273-296 (2010).
- Samuelson, L. C., Hinkle, K. L. Insights into the regulation of gastric acid secretion through analysis of genetically engineered mice. Annual Review of Physiology. 65, 383-400 (2003).
- Yao, X., Forte, J. G. Cell biology of acid secretion by the parietal cell. Annual Review of Physiology. 65, 103-131 (2003).
- Driver, I., Ohlstein, B. Specification of regional intestinal stem cell identity during Drosophila metamorphosis. Development. 141 (9), 1848-1856 (2014).
- Overend, , et al. Molecular mechanism and functional significance of acid generation in the Drosophila midgut. Scientific Reports. 6, 27242 (2016).
- Shanbhag, S., Tripathi, S. Epithelial ultrastructure and cellular mechanisms of acid and base transport in the Drosophila midgut. Journal of Experimental Biology. 212, 1731-1744 (2009).
- Dubreuil, R. R. Copper cells and stomach acid secretion in the Drosophila midgut. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 36 (5), 745-752 (2004).
- Martorell, , et al. Conserved mechanisms of tumorigenesis in the Drosophila adult midgut. PLoS ONE. 9 (2), 88413 (2014).
- Strand, M., Micchelli, C. A. Regional control of Drosophila gut stem cell proliferation: EGF establishes GSSC proliferative set point & controls emergence from quiescence. PLoS One. 8 (11), 80608 (2013).
- Storelli, G., et al. Drosophila perpetuates nutritional mutualism by promoting the fitness of its intestinal symbiont Lactobacillus plantarum. Cell Metabolism. 27 (2), 362-377 (2018).
- Abu, F., et al. Communicating the nutritional value of sugar in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (12), 2829-2838 (2018).
- Blecker, U., Gold, B. D. Gastritis and ulcer disease in childhood. European Journal of Pediatrics. 158 (7), 541-546 (1999).
