Drosofila Comportamento di evitamento passivo come nuovo paradigma per studiare l'apprendimento avversivo associativo
Summary
Questo lavoro descrive un semplice paradigma comportamentale che consente l’analisi dell’apprendimento associativo avversivo nei moscerini della frutta adulti. Il metodo si basa sulla soppressione del comportamento innato della geotaxi negativa a causa dell’associazione formata tra uno specifico contesto ambientale e una scossa elettrica.
Abstract
Questo protocollo descrive un nuovo paradigma per l’analisi dell’apprendimento associativo avversivo nelle mosche adulte (Drosophila melanogaster). Il paradigma è analogo al comportamento di evitamento passivo nei roditori di laboratorio in cui gli animali imparano a evitare un compartimento in cui hanno precedentemente ricevuto una scossa elettrica. Il test sfrutta la geotassi negativa nelle mosche, che si manifesta come un impulso a salire quando sono posizionate su una superficie verticale. La configurazione è costituita da scomparti superiori e inferiori orientati verticalmente. Nella prima prova, una mosca viene posizionata in un compartimento inferiore da dove di solito esce entro 3-15 s e entra nel compartimento superiore dove riceve una scossa elettrica. Durante la seconda prova, 24 ore dopo, la latenza è significativamente aumentata. Allo stesso tempo, il numero di shock è diminuito rispetto al primo studio, indicando che le mosche hanno formato una memoria a lungo termine sul compartimento superiore. Le registrazioni delle latenze e del numero di shock potrebbero essere eseguite con un contatore di conteggi e un cronometro o con un semplice dispositivo basato su Arduino. Per illustrare come il test può essere utilizzato, il comportamento passivo di evitamento di D. melanogaster e D. simulans maschio e femmina sono stati caratterizzati qui. Il confronto tra latenze e numero di shock ha rivelato che sia D. melanogaster che D. simulans vola in modo efficiente hanno imparato il comportamento di evitamento passivo. Non sono state osservate differenze statistiche tra mosche maschili e femminili. Tuttavia, i maschi erano un po ‘più veloci mentre entravano nel compartimento superiore al primo studio, mentre le femmine ricevevano un numero leggermente più alto di shock in ogni prova di ritenzione. La dieta occidentale (WD) ha significativamente compromesso l’apprendimento e la memoria nelle mosche maschio durante l’esercizio di volo controbilanciato questo effetto. Nel complesso, il comportamento passivo di evitamento nelle mosche offre un test semplice e riproducibile che potrebbe essere utilizzato per studiare i meccanismi di base dell’apprendimento e della memoria.
Introduction
L’apprendimento e la memoria sono un meccanismo di adattamento evolutivamente antico all’ambiente, conservato dalla Drosophila (D.) all’uomo1. Il moscerino della frutta è un robusto organismo modello per studiare i principi fondamentali dell’apprendimento e della memoria in quanto offre una vasta gamma di potenti strumenti genetici per sezionare i meccanismi molecolari intrinseci2. I pionieristici studi di screening genetico, che hanno identificato i geni rutabaga3, amnesia4 e dunce5 fondamentali per l’apprendimento e la memoria2, hanno approfittato del condizionamento olfattivo poiché i moscerini della frutta si affidano al loro acuto senso dell’olfatto per trovare cibo, potenziali compagni ed evitare i predatori6.
Il condizionamento olfattivo è diventato un paradigma popolare per studiare il meccanismo dell’apprendimento e della memoria, grazie all’introduzione del labirinto a T olfattivo di Tully e Quinn7,8. Successivamente, sono stati proposti altri metodi per misurare vari tipi di apprendimento e memoria, tra cui il condizionamento visivo9, il condizionamento del corteggiamento10, il saggio di soppressione della fototassi avversiva11 e il condizionamento dell’esposizione alle vespe12. Tuttavia, la maggior parte di questi test ha una configurazione complessa che deve essere costruita su misura in un laboratorio universitario o acquistata tramite un fornitore. Il paradigma qui descritto si basa su un semplice test comportamentale per studiare l’apprendimento associativo avversivo nelle mosche che può essere facilmente assemblato con poche forniture disponibili.
Il paradigma descritto è equivalente al comportamento passivo (o inibitorio) di evitamento nei topi e nei ratti di laboratorio in cui gli animali imparano a evitare un compartimento in cui hanno precedentemente ricevuto scosse elettriche del piede13. Nei muridi, la procedura si basa sulla loro innata evitamento della luce intensa e sulla preferenza per le aree più scure14. Nella prima prova, l’animale viene collocato nel compartimento luminoso, da dove l’animale esce rapidamente, entrando in un compartimento buio, dove viene erogata una scossa elettrica del piede. Di solito, una singola prova è sufficiente per formare una solida memoria a lungo termine, con conseguente aumento significativo della latenza 24 ore dopo. La latenza viene quindi utilizzata come indice della capacità dell’animale di ricordare l’associazione tra lo stimolo avversivo e l’ambiente specifico15.
Questo lavoro descrive una procedura analoga che utilizza D. come sistema modello che offre diversi vantaggi rispetto ai modelli di roditori, tra cui l’economicità, dimensioni del campione più grandi, l’assenza di supervisione normativa e l’accesso a potenti strumenti genetici16,17. La procedura si basa sul comportamento negativo della geotaxi, che si manifesta nell’impulso delle mosche di arrampicarsi quando sono posizionate su una superficie verticale18. La configurazione è composta da due camere verticali. Nella prima prova, un moscerino della frutta viene posizionato in un compartimento inferiore. Da lì, di solito esce entro 3-15 s, entrando nel compartimento superiore dove riceve una scossa elettrica. Durante una prova di 1 minuto, alcune mosche possono occasionalmente rientrare nel compartimento superiore, il che si traduce in un’ulteriore scossa elettrica. Durante la fase di test, 24 ore dopo, la latenza è notevolmente aumentata. Allo stesso tempo, il numero di shock è diminuito rispetto al primo giorno indicando che le mosche hanno formato una memoria associativa avversa sul compartimento superiore. La latenza, il numero di shock e la durata e la frequenza degli attacchi di toelettatura vengono quindi utilizzati per analizzare il comportamento animale e la capacità di formare e ricordare l’associazione tra lo stimolo avversivo e l’ambiente specifico. I risultati rappresentativi rivelano che l’esposizione alla dieta occidentale (WD) compromette significativamente il comportamento di evitamento passivo nelle mosche maschili, suggerendo che il WD influisce profondamente sul comportamento e sulla cognizione della mosca. Al contrario, l’esercizio di volo ha alleviato l’effetto negativo del WD, migliorando il comportamento di evitamento passivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Evitare stimoli minacciosi è una caratteristica cruciale del comportamento adattivo in varie specie, da C. eleganza a umano32. Le procedure di apprendimento evitamento che in genere comportano la fuga di un evento avversivo, sono compiti comportamentali comunemente usati per indagare i processi di apprendimento e memoria nei roditori di laboratorio13 dal 197032. Nelle procedure di evitamento attivo, uno stimolo indifferente o un segnale con…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato supportato in parti da NIH R15ES029673 (AKM).
Materials
| Bloomington Formulation diet | Nutri-Fly | 66-112 | Available from Genesee Scientific Inc., San Diego, CA |
| 1000 µL Blue tip | Fisher | NC9546243 | |
| 17 x 100 mm 14 mL polypropylene culture tube | VWR | 60818-689 | |
| Aduino-based Automatic Kontrol Module | In-house | AKM-007 | This unit is optional. Complete description, schematics, wiring diagram and a code are provided at the ECU Digital Market – https://digitalmarket.ecu.edu/akmmodule |
| Dual-Display 2-Channel Digital Clock/Timer | Digi-Sense | AO-94440-10 | https://www.amazon.com/Cole-Parmer-AO-94440-10-Dual-Display-2-Channel-Jumbo-Digit/dp/B00PR0809G/ref=sr_1_5?dchild=1&keywords=Dual-Display+timer+jumbo&qid=1627660660&sr= 8-5#customerReviews |
| Electronic Finger Counter | N/A | N/A | https://www.amazon.com/gp/product/B01M8IRK6F/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1 |
| Fisherbrand Sparkleen 1 Detergent | Fisher Scientific | 04-320-4 | |
| Fly mouth aspirator | In-house | Prepared as described in reference 19. | |
| Grass S88 stimulator | N/A | N/A | Could be replaced with any stimulator which can provide described parameters |
| Kim-wipes | Fisher Scientific | 06-666 | Kimberly-Clark Professional 34120 |
| Metal block for fly immobilization | In-house | 4 x 13 x 23.5cm aluminum block | |
| Nutiva USDA Certified Organic, non-GMO, Red Palm Oil | Nutiva | N/A | https://www.amazon.com/Nutiva-Certified-Cold-Filtered-Unrefined-Ecuadorian/dp/B00JJ1E83G/ref=sxts_rp_s1_0?cv_ct_cx=Nutiva+USDA+Certified+Organic%2C+non-GMO%2C+Red+Palm+Oil&dchild=1&keywords=Nutiva+USDA+Certified+Organic%2C+non-GMO%2C+Red+Palm+Oil&pd_rd_i=B00JJ1E83G&pd_ rd_r=f35e9d2f-afe4-44b6-afc2-1c9cd705be18&pd_rd_w= R3Zb4&pd_rd_wg=eUv1m&pf_rd_ p=c6bde456-f877-4246-800f-44405f638777&pf _rd_r=M94N11RC7NH333EMJ66Y &psc=1&qid=1627661533&sr=1-1-f0029781-b79b-4b60-9cb0-eeda4dea34d6 |
| Shock tube | CelExplorer | TMA-201 | https://www.celexplorer.com/product_detail.asp?id=217&MainType=110&SubType=8 |
| Stopwatch | Accusplit | A601XLN | https://www.amazon.com/gp/product/B0007ZGZYI/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1 |
| Transparent vinyl tubing (3/4” OD, 5/8” ID) | Lowes | Avaiable from Lowes |
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