Drosófila Comportamento de evasão passiva como um novo paradigma para estudar aprendizagem aversiva associativa
Summary
Este trabalho descreve um simples paradigma comportamental que permite a análise da aprendizagem associativa aversiva em moscas de frutas adultas. O método baseia-se na supressão do comportamento geotaxis negativo inato devido à associação formada entre um contexto ambiental específico e um choque elétrico.
Abstract
Este protocolo descreve um novo paradigma para a análise do aprendizado associativo aversivo em moscas adultas (Drosophila melanogaster). O paradigma é análogo ao comportamento de evasão passiva em roedores de laboratório nos quais os animais aprendem a evitar um compartimento onde já receberam um choque elétrico. O ensaio se aproveita de geotaxis negativos em moscas, que se manifesta como uma vontade de subir quando são colocadas em uma superfície vertical. A configuração consiste em compartimentos superiores e inferiores orientados verticalmente. No primeiro teste, uma mosca é colocada em um compartimento inferior de onde geralmente sai dentro de 3-15 s, e entra no compartimento superior onde recebe um choque elétrico. Durante o segundo julgamento, 24 horas depois, a latência é significativamente aumentada. Ao mesmo tempo, o número de choques é reduzido em comparação com o primeiro ensaio, indicando que as moscas formaram memória de longo prazo sobre o compartimento superior. As gravações de latências e número de choques poderiam ser realizadas com um contador de contagem e um cronômetro ou com um dispositivo simples baseado em Arduino. Para ilustrar como o ensaio pode ser utilizado, o comportamento passivo de evasão de D. melanogaster e D. simulados masculino e feminino foram caracterizados aqui. A comparação das latências e o número de choques revelou que tanto d. melanogaster quanto D. simulados voam eficientemente aprendeu o comportamento de evasão passiva. Não foram observadas diferenças estatísticas entre moscas do sexo masculino e feminino. No entanto, os machos foram um pouco mais rápidos ao entrar no compartimento superior no primeiro ensaio, enquanto as fêmeas receberam um número ligeiramente maior de choques em todos os testes de retenção. A dieta ocidental (WD) prejudicou significativamente o aprendizado e a memória em moscas machos, enquanto o exercício de voo contrabalançava esse efeito. Em conjunto, o comportamento de evasão passiva em moscas oferece um ensaio simples e reprodutível que poderia ser usado para estudar mecanismos básicos de aprendizagem e memória.
Introduction
O aprendizado e a memória são um mecanismo de adaptação evolutivamente antigo ao meio ambiente, conservado de Drosophila (D.) para humano1. A mosca-das-frutas é um organismo modelo robusto para estudar princípios fundamentais de aprendizagem e memória, pois oferece uma ampla gama de poderosas ferramentas genéticas para dissecar mecanismos moleculares intrínsecos2. Os pioneiros estudos de triagem genética, que identificaram os genes rutabaga3, amnésiac4 e dunce5 críticos para o aprendizado e memória2, aproveitaram-se do condicionamento olfativo à medida que as moscas das frutas dependem de seu agudo olfato para encontrar comida, potenciais companheiros e evitar predadores6.
O condicionamento olfativo tornou-se um paradigma popular para estudar o mecanismo de aprendizagem e memória, graças à introdução do olfativo T-maze por Tully e Quinn7,8. Posteriormente, foram propostos outros métodos para medir vários tipos de aprendizagem e memória, incluindo condicionamento visual9, condicionamento de namoro10, ensaio de supressão de fototaxis aversiva11 e condicionamento de exposição de vespas12. No entanto, a maioria desses ensaios tem uma configuração complexa que deve ser feita sob medida em uma oficina universitária ou comprada através de um fornecedor. O paradigma descrito aqui baseia-se em um simples ensaio comportamental para estudar o aprendizado associativo aversivo em moscas que podem ser facilmente montados com alguns suprimentos disponíveis.
O paradigma descrito equivale ao comportamento passivo (ou inibitório) de evasão em ratos e ratos de laboratório em que os animais aprendem a evitar um compartimento onde já receberam choque elétrico no pé13. Em murids, o procedimento baseia-se em sua prevenção inata de luz brilhante e preferência por áreas mais escuras14. No primeiro ensaio, o animal é colocado no compartimento brilhante, de onde o animal sai rapidamente, entrando em um compartimento escuro, onde um choque elétrico no pé é entregue. Normalmente, um único ensaio é suficiente para formar uma memória sólida de longo prazo, resultando em uma latência significativamente aumentada 24 h depois. A latência é então usada como um índice da capacidade do animal de lembrar a associação entre o estímulo aversivo e o ambiente específico15.
Este trabalho descreve um procedimento análogo usando D. como um sistema de modelo que oferece várias vantagens sobre modelos de roedores, incluindo custo-efetividade, maior tamanho amostral, ausência de supervisão regulatória e acesso a poderosas ferramentas genéticas16,17. O procedimento é baseado no comportamento geotaxis negativo, que se manifesta na necessidade das moscas de subir quando são colocadas em uma superfície vertical18. A configuração consiste em duas câmaras verticais. No primeiro ensaio, uma mosca-das-frutas é colocada em um compartimento inferior. A partir daí, geralmente sai dentro de 3-15 s, pisando no compartimento superior onde recebe um choque elétrico. Durante um teste de 1 min, algumas moscas podem ocasionalmente reentrar no compartimento superior, o que resulta em um choque elétrico adicional. Durante a fase de testes, 24 horas depois, a latência é significativamente aumentada. Ao mesmo tempo, o número de choques é reduzido em comparação com o primeiro dia indicando que as moscas formaram memória associativa aversiva sobre o compartimento superior. A latência, o número de choques e a duração e frequência das crises de preparação são então usados para analisar o comportamento animal e a capacidade de formar e lembrar a associação entre o estímulo aversivo e o ambiente específico. Os resultados representativos revelam que a exposição à dieta ocidental (WD) prejudica significativamente o comportamento de evasão passiva em moscas masculinas, sugerindo que o WD impacta profundamente o comportamento e a cognição da mosca. Por outro lado, o exercício de voo aliviou o efeito negativo do WD, melhorando o comportamento de evasão passiva.
Protocol
Representative Results
Discussion
Evitar estímulos ameaçadores é uma característica crucial do comportamento adaptativo em várias espécies, desde a elegância C. até a humana32. Procedimentos de aprendizagem de evasão que normalmente implicam a fuga de um evento aversivo, são comumente usados tarefas comportamentais para investigar processos de aprendizagem e memória em roedores de laboratório13 desde a década de 1970 32. Em procedimentos de evasão ativa, um est…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado em partes pelo NIH R15ES029673 (AKM).
Materials
| Bloomington Formulation diet | Nutri-Fly | 66-112 | Available from Genesee Scientific Inc., San Diego, CA |
| 1000 µL Blue tip | Fisher | NC9546243 | |
| 17 x 100 mm 14 mL polypropylene culture tube | VWR | 60818-689 | |
| Aduino-based Automatic Kontrol Module | In-house | AKM-007 | This unit is optional. Complete description, schematics, wiring diagram and a code are provided at the ECU Digital Market – https://digitalmarket.ecu.edu/akmmodule |
| Dual-Display 2-Channel Digital Clock/Timer | Digi-Sense | AO-94440-10 | https://www.amazon.com/Cole-Parmer-AO-94440-10-Dual-Display-2-Channel-Jumbo-Digit/dp/B00PR0809G/ref=sr_1_5?dchild=1&keywords=Dual-Display+timer+jumbo&qid=1627660660&sr= 8-5#customerReviews |
| Electronic Finger Counter | N/A | N/A | https://www.amazon.com/gp/product/B01M8IRK6F/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1 |
| Fisherbrand Sparkleen 1 Detergent | Fisher Scientific | 04-320-4 | |
| Fly mouth aspirator | In-house | Prepared as described in reference 19. | |
| Grass S88 stimulator | N/A | N/A | Could be replaced with any stimulator which can provide described parameters |
| Kim-wipes | Fisher Scientific | 06-666 | Kimberly-Clark Professional 34120 |
| Metal block for fly immobilization | In-house | 4 x 13 x 23.5cm aluminum block | |
| Nutiva USDA Certified Organic, non-GMO, Red Palm Oil | Nutiva | N/A | https://www.amazon.com/Nutiva-Certified-Cold-Filtered-Unrefined-Ecuadorian/dp/B00JJ1E83G/ref=sxts_rp_s1_0?cv_ct_cx=Nutiva+USDA+Certified+Organic%2C+non-GMO%2C+Red+Palm+Oil&dchild=1&keywords=Nutiva+USDA+Certified+Organic%2C+non-GMO%2C+Red+Palm+Oil&pd_rd_i=B00JJ1E83G&pd_ rd_r=f35e9d2f-afe4-44b6-afc2-1c9cd705be18&pd_rd_w= R3Zb4&pd_rd_wg=eUv1m&pf_rd_ p=c6bde456-f877-4246-800f-44405f638777&pf _rd_r=M94N11RC7NH333EMJ66Y &psc=1&qid=1627661533&sr=1-1-f0029781-b79b-4b60-9cb0-eeda4dea34d6 |
| Shock tube | CelExplorer | TMA-201 | https://www.celexplorer.com/product_detail.asp?id=217&MainType=110&SubType=8 |
| Stopwatch | Accusplit | A601XLN | https://www.amazon.com/gp/product/B0007ZGZYI/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1 |
| Transparent vinyl tubing (3/4” OD, 5/8” ID) | Lowes | Avaiable from Lowes |
Referências
- Kandel, E. R., Dudai, Y., Mayford, M. R. The molecular and systems biology of memory. Cell. 157 (1), 163-186 (2014).
- McGuire, S. E., Deshazer, M., Davis, R. L. Thirty years of olfactory learning and memory research in Drosophila melanogaster. Progress in Neurobiology. 76 (5), 328-347 (2005).
- Livingstone, M. S., Sziber, P. P., Quinn, W. G. Loss of calcium/calmodulin responsiveness in adenylate cyclase of rutabaga, a Drosophila learning mutant. Cell. 37 (1), 205-215 (1984).
- Quinn, W. G., Sziber, P. P., Booker, R. The Drosophila memory mutant amnesiac. Nature. 277 (5693), 212-214 (1979).
- Dudai, Y., Jan, Y. N., Byers, D., Quinn, W. G., Benzer, S. dunce, a mutant of Drosophila deficient in learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73 (5), 1684-1688 (1976).
- Busto, G. U., Cervantes-Sandoval, I., Davis, R. L. Olfactory learning in Drosophila. Physiology. 25 (6), 338-346 (2010).
- Tully, T., Quinn, W. G. Classical conditioning and retention in normal and mutant Drosophila melanogaster. Journal of Comparative Physiology. A: Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 157 (2), 263-277 (1985).
- Wright, N. J. Evolution of the techniques used in studying associative olfactory learning and memory in adult Drosophila in vivo: A historical and technical perspective. Invertebrate Neuroscience. 14 (1), 1-11 (2014).
- Vogt, K., Yarali, A., Tanimoto, H. Reversing stimulus timing in visual conditioning leads to memories with opposite valence in Drosophila. PloS One. 10 (10), 0139797 (2015).
- Koemans, T. S., et al. Drosophila courtship conditioning as a measure of learning and memory. Journal of Visualized Experiments. (124), e55808 (2017).
- Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments. (49), e2504 (2011).
- Bozler, J., et al. A systems level approach to temporal expression dynamics in Drosophila reveals clusters of long term memory genes. Plos Genetics. 13 (10), 1007054 (2017).
- Atucha, E., Roozendaal, B. The inhibitory avoidance discrimination task to investigate accuracy of memory. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 9, 60 (2015).
- Thiels, E., Hoffman, E. K., Gorin, M. B. A reliable behavioral assay for the assessment of sustained photophobia in mice. Current Eye Research. 33 (5), 483-491 (2008).
- Detrait, E. R., Hanon, E., Dardenne, B., Lamberty, Y. The inhibitory avoidance test optimized for discovery of cognitive enhancers. Behavior Research Methods. 41 (3), 805-811 (2009).
- Piper, M. D. W., Partridge, L. Drosophila as a model for ageing. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. 1864 (9), 2707-2717 (2018).
- Chalmers, J., et al. A multicomponent screen for feeding behaviour and nutritional status in Drosophila to interrogate mammalian appetite-related genes. Molecular Metabolism. 43, 101127 (2021).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental Gerontology. 40 (5), 386-395 (2005).
- Yang, D. Simple homemade tools to handle fruit flies-Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (149), e59613 (2019).
- Barradale, F., Sinha, K., Lebestky, T. Quantification of Drosophila grooming behavior. Journal of Visualized Experiments. (125), e55231 (2017).
- Denmark, A., et al. The effects of chronic social defeat stress on mouse self-grooming behavior and its patterning. Behavioural Brain Research. 208 (2), 553-559 (2010).
- Kalueff, A. V., et al. Neurobiology of rodent self-grooming and its value for translational neuroscience. Nature Reviews: Neuroscience. 17 (1), 45-59 (2016).
- Motulsky, H. . Intuitive biostatistics: A nonmathematical guide to statistical thinking. Fourth edition. , (2018).
- Qiao, B., Li, C., Allen, V. W., Shirasu-Hiza, M., Syed, S. Automated analysis of long-term grooming behavior in Drosophila using a k-nearest neighbors classifier. Elife. 7, 34497 (2018).
- Mu, M. D., et al. A limbic circuitry involved in emotional stress-induced grooming. Nature Communications. 11 (1), 2261 (2020).
- Song, C., Berridge, K. C., Kalueff, A. V. Stressing’ rodent self-grooming for neuroscience research. Nature Reviews: Neuroscience. 17 (9), 591 (2016).
- Wang, C., Chan, J. S., Ren, L., Yan, J. H. Obesity reduces cognitive and motor functions across the lifespan. Neural Plasticity. 2016, 2473081 (2016).
- Lewis, A. R., Singh, S., Youssef, F. F. Cafeteria-diet induced obesity results in impaired cognitive functioning in a rodent model. Heliyon. 5 (3), 01412 (2019).
- Yohn, S. E., Galbraith, J., Calipari, E. S., Conn, P. J. Shared behavioral and neurocircuitry disruptions in drug addiction, obesity, and binge eating disorder: Focus on Group I mGluRs in the mesolimbic dopamine pathway. ACS Chemical Neuroscience. 10 (5), 2125-2143 (2019).
- Lopez-Taboada, I., Gonzalez-Pardo, H., Conejo, N. M. Western Diet: Implications for brain function and behavior. Frontiers in Psychololgy. 11, 564413 (2020).
- Murashov, A. K., et al. Preference and detrimental effects of high fat, sugar, and salt diet in wild-caught Drosophila simulans are reversed by flight exercise. FASEB Bioadvances. 3 (1), 49-64 (2021).
- Krypotos, A. M., Effting, M., Kindt, M., Beckers, T. Avoidance learning: A review of theoretical models and recent developments. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 9, 189 (2015).
- Binder, M. D., Hirokawa, N., Windhorst, U. . Encyclopedia of Neuroscience. , 3093 (2009).
- Mery, F., Belay, A. T., So, A. K., Sokolowski, M. B., Kawecki, T. J. Natural polymorphism affecting learning and memory in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (32), 13051-13055 (2007).
- Tan, Y., Yu, D., Pletting, J., Davis, R. L. Gilgamesh is required for rutabaga-independent olfactory learning in Drosophila. Neuron. 67 (5), 810-820 (2010).
- Ögren, S. O., Stiedl, O., Stolerman, I. P. . Encyclopedia of Psychopharmacology. , 960-967 (2010).
