测定带状纤维粘弹性的生物制备及机械技术
Summary
该协议描述了研究细胞外基质粘弹性及其对蛋白质组成或环境因素的依赖性的方法。目标基质系统是鼠标区域。通过比较野生型带状纤维与缺乏微纤维相关糖蛋白-1的粘弹性行为来证明该方法的性能。
Abstract
弹性对于血管、肌肉和肺等组织的功能至关重要。这种性质主要来自细胞外基质（ECM），这是将细胞和组织结合在一起的蛋白质网状物。ECM网络的弹性特性如何与其组成相关，以及ECM的弛豫特性是否起生理作用，都是尚未完全解决的问题。部分挑战在于大多数 ECM 系统的复杂架构，以及在不影响其结构的情况下隔离 ECM 组件的困难。一个例外是区域，这是一种在脊椎动物眼中发现的ECM系统。该区域由数百至数千微米长的纤维组成，横跨晶状体和眼壁之间的无细胞空间。在本报告中，我们描述了一种机械技术，该技术利用区域的高度组织结构来量化其粘弹性并确定单个蛋白质组分的贡献。该方法涉及解剖固定的眼睛以暴露晶状体和区域，并采用引体向上技术，在监测其张力的同时均匀拉伸带状纤维。该技术相对便宜，但灵敏度足以检测缺乏特定区域蛋白或随着年龄的增长而产生的小鼠中区域纤维粘弹性特性的改变。虽然这里介绍的方法主要用于研究眼发育和疾病，但它也可以作为一个实验模型，用于探索有关弹性ECM的粘弹性性质以及外部因素（如离子浓度，温度和与信号分子的相互作用）的作用的更广泛问题。
Introduction
脊椎动物的眼睛包含一个活的光学晶状体，有助于将图像聚焦在视网膜上1。透镜通过一组精密的径向光纤悬挂在光轴上，如图1A所示。在一端，纤维附着在晶状体赤道上，在另一端，附着在睫状体的表面上。它们的长度范围从小鼠的150μm到人类的1 mm。这些纤维统称为Zinn2的带状体，睫状状体，或简称为状状带。眼外伤、疾病和某些遗传性疾病可影响区域纤维的完整性3，导致其最终衰竭并伴随视力丧失。在小鼠中，纤维的核心主要由蛋白质纤维菌素-2组成，周围是富含纤毛素-14的地幔。虽然区域纤维是眼睛独有的，但它们与身体其他部位发现的基于弹性蛋白的ECM纤维有许多相似之处。后者由纤毛素-1地幔5覆盖，并且具有与带状纤维相似的尺寸6。其他蛋白质，如潜伏转化生长因子β结合蛋白（LTBPs）和微纤维相关糖蛋白-1（MAGP-1），与两种类型的纤维有关7，8，9，10，11。带状纤维的弹性模量在0.18~1.50 MPa12、13、14、15、16之间，与弹性蛋白基纤维（0.3~1.2 MPa）相当17.这些结构和机械上的相似性使我们相信，对区域相关蛋白质的作用的任何见解都可能有助于阐明它们在其他ECM弹性纤维中的作用。
开发这里描述的方法的主要目的是深入了解特定区域蛋白在遗传性眼病进展中的作用。一般方法是将野生型小鼠中带状纤维的粘弹性与携带编码区状蛋白基因的靶向突变的小鼠的粘弹性特性进行比较。虽然以前已经使用了几种方法来测量带状纤维的弹性力学性能，但所有这些都是为更大的动物的眼睛设计的12，13，14，15，16。由于这些模型在遗传上是不可处理的;我们试图开发一种更适合小鼠小而细腻的眼睛的实验方法。
我们开发的用于评估小鼠区域纤维粘弹性的方法是我们称之为上拉测定法4，18的技术，如图1直观地总结。下面详细介绍了上拉方法和对结果的分析。我们首先描述设备的构造，包括项目中使用的三维（3D）打印部件。接下来，我们详细介绍了用于获取和准备实验眼睛的方案。最后，我们提供了有关如何获取数据以确定带状纤维粘弹性的分步说明。在代表性结果部分，我们分享了以前未发表的数据，这些数据来自缺乏MAGP-119的小鼠的带状纤维的粘弹性特性，以及从年龄匹配的野生型动物获得的对照集。最后，我们总结了该方法的优点和局限性的一般性评论，并提出了可能阐明环境和生化因素如何影响ECM纤维粘弹性的潜在实验的建议。
Protocol
Representative Results
Discussion
区域是一种不寻常的ECM系统，其中光纤对称排列，并且可以通过沿光轴置换眼镜片来相同地操纵。该空间也可以很容易地进入而不会破坏细胞，从而允许在接近其原始状态的环境中研究纤维。引体向上技术利用这种ECM演示来操纵来自小鼠的脆弱纤维，这是一个遗传上可处理的系统，并准确地量化其机械性能。这使我们能够检查关键ECM蛋白（原纤维化素-118，LTBP-24和此处报道的MAGP-…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了NIH R01 EY029130（S.B.）和P30 EY002687（S.B.），R01 HL53325和Ines Mandl研究基金会（R.P.M.），马凡基金会的支持，以及华盛顿大学眼科和视觉科学系的无限制资助，用于预防失明。J.R.还获得了健康科学与药学院的资助，以支持该项目。
Materials
| 1/4-20 hex screws 3/4 inch long | Thorlabs | SH25S075 | |
| 1/4-20 nut | Hardware store | ||
| 3D SLA printer | Anycubic | Photon | |
| 4-40 screws 3/8 inch long, 2 | Hardware store | ||
| Capillaries, OD 1.2 mm and 3 inches long, no filament | WPI | 1B120-3 | |
| Cyanoacrylate (super) glue | Loctite | ||
| Digital Scale accurate to 0.01 g | Vernier | OHAUS Scout 220 | |
| Excel | Microsoft | Spreadsheet | |
| Gas cigarette lighter | |||
| Inspection/dissection microscope | Amscope | SKU: SM-4NTP | Working distance ~ 15 cm |
| Micromanipulator, Economy 4-axis | WPI | Kite-L | |
| Motorized micrometer | Thorlabs | Z812B | |
| Negative cylindrical lens | Thorlabs | LK1431L1 | -75 mm focal length |
| Petri dishes, 50 mm | |||
| Post holder, 3 inches | Thorlabs | PH3 | |
| Post, 4 inches | Thorlabs | TR4 | |
| Scale logging software | Vernier | LoggePro | |
| Servo motor controller | Thorlabs | KDC101 | |
| Servo motor controller software | Thorlabs | APT | |
| Slotted base, 1 | Thorlabs | BA1S | |
| Slotted bases, 2 | Thorlabs | BA2 | |
| Stand for micromanipular | WPI | M-10 | |
| USB-camera for microscope | Amscope | SKU: MD500 | |
| UV activated glue with UV source | Amazon |
Referências
- Bassnett, S., Shi, Y., Vrensen, G. F. Biological glass: structural determinants of eye lens transparency. Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1568), 1250-1264 (2011).
- Bassnett, S. Zinn’s zonule. Progress in Retinal and Eye Research. 82, 100902 (2021).
- Dureau, P. Pathophysiology of zonular diseases. Current Opinion in Ophthalmology. 19 (1), 27-30 (2008).
- Shi, Y., et al. Latent-transforming growth factor beta-binding protein-2 (LTBP-2) is required for longevity but not for development of zonular fibers. Matrix Biology. 95, 15-31 (2021).
- Ushiki, T. Collagen fibers, reticular fibers and elastic fibers. A comprehensive understanding from a morphological viewpoint. Archives of Histology and Cytology. 65 (2), 109-126 (2002).
- Bassnett, S. A method for preserving and visualizing the three-dimensional structure of the mouse zonule. Experimental Eye Research. 185, 107685 (2019).
- Todorovic, V., Rifkin, D. B. LTBPs, more than just an escort service. Journal of Cellular Biochemistry. 113 (2), 410-418 (2012).
- Mecham, R. P., Gibson, M. A. The microfibril-associated glycoproteins (MAGPs) and the microfibrillar niche. Matrix Biology. 47, 13-33 (2015).
- Hubmacher, D., Reinhardt, D. P., Plesec, T., Schenke-Layland, K., Apte, S. S. Human eye development is characterized by coordinated expression of fibrillin isoforms. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (12), 7934-7944 (2014).
- Inoue, T., et al. Latent TGF-β binding protein-2 is essential for the development of ciliary zonule microfibrils. Human Molecular Genetics. 23 (21), 5672-5682 (2014).
- De Maria, A., Wilmarth, P. A., David, L. L., Bassnett, S. Proteomic analysis of the bovine and human ciliary zonule. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (1), 573-585 (2017).
- Wright, D. M., Duance, V. C., Wess, T. J., Kielty, C. M., Purslow, P. P. The supramolecular organization of fibrillin-rich microfibrils determines the mechanical properties of bovine zonular filaments. Journal of Experimental Biology. 202 (21), 3011-3020 (1999).
- Bocskai, Z. I., Sandor, G. L., Kiss, Z., Bojtar, I., Nagy, Z. Z. Evaluation of the mechanical behaviour and estimation of the elastic properties of porcine zonular fibres. Journal of Biomechanics. 47 (13), 3264-3271 (2014).
- Fisher, R. F. The ciliary body in accommodation. Transactions of the Ophthalmological Societies of the United Kingdom. 105, 208-219 (1986).
- Michael, R., et al. Elastic properties of human lens zonules as a function of age in presbyopes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (10), 6109-6114 (2012).
- van Alphen, G. W., Graebel, W. P. Elasticity of tissues involved in accommodation. Vision Research. 31 (7-8), 1417-1438 (1991).
- Green, E. M., Mansfield, J. C., Bell, J. S., Winlove, C. P. The structure and micromechanics of elastic tissue. Interface Focus. 4 (2), 20130058 (2014).
- Jones, W., Rodriguez, J., Bassnett, S. Targeted deletion of fibrillin-1 in the mouse eye results in ectopia lentis and other ocular phenotypes associated with Marfan syndrome. Disease Models & Mechanisms. 12 (1), 037283 (2019).
- Weinbaum, J. S., et al. Deficiency in microfibril-associated glycoprotein-1 leads to complex phenotypes in multiple organ systems. Journal of Biological Chemistry. 283 (37), 25533-25543 (2008).
- Comeglio, P., Evans, A. L., Brice, G., Cooling, R. J., Child, A. H. Identification of FBN1 gene mutations in patients with ectopia lentis and marfanoid habitus. British Journal of Ophthalmology. 86 (12), 1359-1362 (2002).
