Биологический препарат и механическая методика определения вязкоупругих свойств зональных волокон
Summary
Протокол описывает метод исследования вязкоупругости внеклеточного матрикса и его зависимости от белкового состава или факторов внешней среды. Целевой матричной системой является зонул мыши. Эффективность метода демонстрируется путем сравнения вязкоупругогого поведения зональных волокон дикого типа с теми, в которых отсутствует микрофибрил-ассоциированный гликопротеин-1.
Abstract
Эластичность имеет важное значение для функции тканей, таких как кровеносные сосуды, мышцы и легкие. Это свойство получено в основном из внеклеточного матрикса (ECM), белковой сетки, которая связывает клетки и ткани вместе. Как упругие свойства сети ECM связаны с ее составом, и играют ли релаксационные свойства ECM физиологическую роль, являются вопросами, которые еще предстоит полностью решить. Часть проблемы заключается в сложной архитектуре большинства ECM-систем и сложности изоляции компонентов ECM без ущерба для их структуры. Одним из исключений является зонула, система ECM, обнаруженная в глазу позвоночных. Зонула содержит волокна длиной от сотен до тысяч микрометров, которые охватывают бесклеточное пространство между линзой и глазной стенкой. В этом отчете мы описываем механический метод, который использует преимущества высокоорганизованной структуры зонулы для количественной оценки ее вязкоупругих свойств и определения вклада отдельных белковых компонентов. Метод включает в себя рассечение фиксированного глаза для обнажения хрусталика и зонулы и использует технику подтягивания, которая растягивает зонулярные волокна одинаково, пока контролируется их натяжение. Метод относительно недорогой, но достаточно чувствительный, чтобы обнаружить изменения в вязкоупругих свойствах зонулярных волокон у мышей, у которых отсутствуют специфические зонулярные белки или при старении. Хотя метод, представленный здесь, предназначен в первую очередь для изучения глазного развития и заболеваний, он также может служить экспериментальной моделью для изучения более широких вопросов, касающихся вязкоупругих свойств упругих ECM и роли внешних факторов, таких как концентрация ионов, температура и взаимодействия с сигнальными молекулами.
Introduction
Глаз позвоночного содержит живую оптическую линзу, которая помогает фокусировать изображения на сетчатке1. Линза подвешена на оптической оси системой тонких, радиально ориентированных волокон, как показано на рисунке 1А. На одном конце волокна прикрепляются к экватору хрусталика, а на другом — к поверхности цилиарного тела. Их длина охватывает расстояния от 150 мкм у мышей до 1 мм у людей. В совокупности эти волокна известны как зонула Zinn2, цилиарная зону или просто зонула. Глазная травма, заболевание и некоторые генетические нарушения могут повлиять на целостность зонулярных волокон3, что приводит к их возможному отказу и сопутствующей потере зрения. У мышей волокна имеют ядро, состоящее в основном из белка фибриллина-2, окруженного мантией, богатой фибриллином-14. Хотя зональные волокна уникальны для глаза, они имеют много общего с волокнами ECM на основе эластина, обнаруженными в других частях тела. Последние покрыты мантией фибриллина-15 и имеют размеры, аналогичные зональным волокнам6. Другие белки, такие как латентно-трансформирующий фактор роста β-связывающие белки (LTBPs) и микрофибрил-ассоциированный гликопротеин-1 (MAGP-1), встречаются в ассоциации с обоими типами волокон7,8,9,10,11. Модуль упругости зональных волокон находится в диапазоне 0,18-1,50 МПа12,13,14,15,16, что сопоставимо с модулем волокон на основе эластина (0,3-1,2 МПа)17. Эти архитектурные и механические сходства заставляют нас полагать, что любое понимание ролей зонул-ассоциированных белков может помочь прояснить их роль в других эластических волокнах ECM.
Основная цель разработки метода, описанного здесь, заключается в том, чтобы получить представление о роли специфических зонулярных белков в прогрессировании наследственного заболевания глаз. Общий подход заключается в сравнении вязкоупругих свойств зональных волокон у мышей дикого типа с свойствами мышей, несущих целевые мутации в генах, кодирующих зонулярные белки. Хотя ранее для измерения эластомеханических свойств зональных волокон использовалось несколько методов, все они были разработаны для глаз гораздо более крупных животных12,13,14,15,16. Поскольку такие модели генетически не поддаются обработке; мы стремились разработать экспериментальный метод, который лучше подходил бы для маленьких и нежных глаз мышей.
Метод, который мы разработали для оценки вязкоупругости зональных волокон мыши, представляет собой метод, который мы называем анализом подтягивания4,18, который обобщен визуально на рисунке 1. Подробное описание метода подтягивания и анализ результатов приводится ниже. Начнем с описания конструкции аппарата, включая трехмерные (3D)-печатные детали, используемые в проекте. Далее мы подробно описываем протокол, используемый для получения и подготовки глаз к эксперименту. Наконец, мы предоставляем пошаговые инструкции о том, как получить данные для определения вязкоупругих свойств зональных волокон. В разделе «Репрезентативные результаты» мы делимся ранее неопубликованными данными, полученными с помощью нашего метода, о вязкоупругих свойствах зональных волокон у мышей, лишенных MAGP-119, а также контрольным набором, полученным от животных дикого типа, соответствующих возрасту. Наконец, мы завершаем общими замечаниями о преимуществах и ограничениях метода, а также предложениями для потенциальных экспериментов, которые могут прояснить, как экологические и биохимические факторы влияют на вязкоупругие свойства волокон ECM.
Protocol
Representative Results
Discussion
Зонула представляет собой необычную систему ECM, где волокна расположены симметрично и ими можно манипулировать идентично, смещая глазную линзу вдоль оптической оси. Пространство также может быть легко доступно без клеточного разрушения, что позволяет изучать волокна в среде, близкой ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана NIH R01 EY029130 (S.B.) и P30 EY002687 (S.B.), R01 HL53325 и Инес Мандл Research Foundation (R.P.M.), Фондом Марфана, а также неограниченным грантом Департаменту офтальмологии и визуальных наук Вашингтонского университета от Исследований по предотвращению слепоты. J.R. также получил грант от Университета медицинских наук и фармации в поддержку этого проекта.
Materials
| 1/4-20 hex screws 3/4 inch long | Thorlabs | SH25S075 | |
| 1/4-20 nut | Hardware store | ||
| 3D SLA printer | Anycubic | Photon | |
| 4-40 screws 3/8 inch long, 2 | Hardware store | ||
| Capillaries, OD 1.2 mm and 3 inches long, no filament | WPI | 1B120-3 | |
| Cyanoacrylate (super) glue | Loctite | ||
| Digital Scale accurate to 0.01 g | Vernier | OHAUS Scout 220 | |
| Excel | Microsoft | Spreadsheet | |
| Gas cigarette lighter | |||
| Inspection/dissection microscope | Amscope | SKU: SM-4NTP | Working distance ~ 15 cm |
| Micromanipulator, Economy 4-axis | WPI | Kite-L | |
| Motorized micrometer | Thorlabs | Z812B | |
| Negative cylindrical lens | Thorlabs | LK1431L1 | -75 mm focal length |
| Petri dishes, 50 mm | |||
| Post holder, 3 inches | Thorlabs | PH3 | |
| Post, 4 inches | Thorlabs | TR4 | |
| Scale logging software | Vernier | LoggePro | |
| Servo motor controller | Thorlabs | KDC101 | |
| Servo motor controller software | Thorlabs | APT | |
| Slotted base, 1 | Thorlabs | BA1S | |
| Slotted bases, 2 | Thorlabs | BA2 | |
| Stand for micromanipular | WPI | M-10 | |
| USB-camera for microscope | Amscope | SKU: MD500 | |
| UV activated glue with UV source | Amazon |
Referências
- Bassnett, S., Shi, Y., Vrensen, G. F. Biological glass: structural determinants of eye lens transparency. Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1568), 1250-1264 (2011).
- Bassnett, S. Zinn’s zonule. Progress in Retinal and Eye Research. 82, 100902 (2021).
- Dureau, P. Pathophysiology of zonular diseases. Current Opinion in Ophthalmology. 19 (1), 27-30 (2008).
- Shi, Y., et al. Latent-transforming growth factor beta-binding protein-2 (LTBP-2) is required for longevity but not for development of zonular fibers. Matrix Biology. 95, 15-31 (2021).
- Ushiki, T. Collagen fibers, reticular fibers and elastic fibers. A comprehensive understanding from a morphological viewpoint. Archives of Histology and Cytology. 65 (2), 109-126 (2002).
- Bassnett, S. A method for preserving and visualizing the three-dimensional structure of the mouse zonule. Experimental Eye Research. 185, 107685 (2019).
- Todorovic, V., Rifkin, D. B. LTBPs, more than just an escort service. Journal of Cellular Biochemistry. 113 (2), 410-418 (2012).
- Mecham, R. P., Gibson, M. A. The microfibril-associated glycoproteins (MAGPs) and the microfibrillar niche. Matrix Biology. 47, 13-33 (2015).
- Hubmacher, D., Reinhardt, D. P., Plesec, T., Schenke-Layland, K., Apte, S. S. Human eye development is characterized by coordinated expression of fibrillin isoforms. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (12), 7934-7944 (2014).
- Inoue, T., et al. Latent TGF-β binding protein-2 is essential for the development of ciliary zonule microfibrils. Human Molecular Genetics. 23 (21), 5672-5682 (2014).
- De Maria, A., Wilmarth, P. A., David, L. L., Bassnett, S. Proteomic analysis of the bovine and human ciliary zonule. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (1), 573-585 (2017).
- Wright, D. M., Duance, V. C., Wess, T. J., Kielty, C. M., Purslow, P. P. The supramolecular organization of fibrillin-rich microfibrils determines the mechanical properties of bovine zonular filaments. Journal of Experimental Biology. 202 (21), 3011-3020 (1999).
- Bocskai, Z. I., Sandor, G. L., Kiss, Z., Bojtar, I., Nagy, Z. Z. Evaluation of the mechanical behaviour and estimation of the elastic properties of porcine zonular fibres. Journal of Biomechanics. 47 (13), 3264-3271 (2014).
- Fisher, R. F. The ciliary body in accommodation. Transactions of the Ophthalmological Societies of the United Kingdom. 105, 208-219 (1986).
- Michael, R., et al. Elastic properties of human lens zonules as a function of age in presbyopes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (10), 6109-6114 (2012).
- van Alphen, G. W., Graebel, W. P. Elasticity of tissues involved in accommodation. Vision Research. 31 (7-8), 1417-1438 (1991).
- Green, E. M., Mansfield, J. C., Bell, J. S., Winlove, C. P. The structure and micromechanics of elastic tissue. Interface Focus. 4 (2), 20130058 (2014).
- Jones, W., Rodriguez, J., Bassnett, S. Targeted deletion of fibrillin-1 in the mouse eye results in ectopia lentis and other ocular phenotypes associated with Marfan syndrome. Disease Models & Mechanisms. 12 (1), 037283 (2019).
- Weinbaum, J. S., et al. Deficiency in microfibril-associated glycoprotein-1 leads to complex phenotypes in multiple organ systems. Journal of Biological Chemistry. 283 (37), 25533-25543 (2008).
- Comeglio, P., Evans, A. L., Brice, G., Cooling, R. J., Child, A. H. Identification of FBN1 gene mutations in patients with ectopia lentis and marfanoid habitus. British Journal of Ophthalmology. 86 (12), 1359-1362 (2002).
