구역 섬유의 점탄성 특성을 결정하기 위한 생물학적 제제 및 기계적 기술
Summary
프로토콜은 세포외 매트릭스 점성 및 단백질 조성 또는 환경 요인에 대한 의존성 연구를 위한 방법을 설명합니다. 대상 매트릭스 시스템은 마우스 구역입니다. 이 방법의 성능은 야생식 구역 섬유의 점탄성 거동을 미세피브릴 관련 당단백질-1이 부족한 것과 비교하여 입증된다.
Abstract
탄력은 혈관, 근육 및 폐와 같은 조직의 기능에 필수적입니다. 이 성질은 세포와 조직을 함께 결합하는 단백질 메쉬워크인 세포외 매트릭스(ECM)에서 주로 유래된다. ECM 네트워크의 탄성 특성이 그 구성과 어떻게 관련이 있는지, 그리고 ECM의 이완 특성이 생리적 역할을 하는지 여부는 아직 완전히 해결되지 않은 질문입니다. 과제의 일부는 대부분의 ECM 시스템의 복잡한 아키텍처와 구조를 손상시키지 않으면서 ECM 구성 요소를 분리하는 데 어려움을 가지는 것입니다. 한 가지 예외는 척추 동물의 눈에서 발견되는 ECM 시스템인 조눌(zonule)입니다. 구역은 렌즈와 안벽 사이의 세포 없는 공간에 걸쳐 길이가 수백에서 수천 마이크로미터의 섬유를 포함한다. 이 보고서에서는 구역의 고도로 조직된 구조를 활용하여 점성탄성 특성을 정량화하고 개별 단백질 성분의 기여를 결정하는 기계 기술을 설명합니다. 이 방법은 렌즈와 구역을 노출하기 위해 고정 된 눈의 해부를 포함하고 장력을 모니터링하는 동안 구역 섬유를 동등하게 뻗어당기는 풀업 기술을 사용합니다. 이 기술은 상대적으로 저렴하지만 특정 구역 단백질이 부족하거나 노화가 있는 마우스의 구역 섬유의 점탄성 특성의 변화를 감지할 만큼 민감합니다. 여기에 제시된 방법은 주로 안구 발달 과 질병을 연구하기 위해 설계되었지만, 탄성 ECM의 점탄성 특성및 이온 농도, 온도 및 신호 분자와의 상호 작용과 같은 외부 요인의 역할에 관한 광범위한 질문을 탐구하기위한 실험 모델역할을 할 수 있습니다.
Introduction
척추 동물의 눈에는 망막1에 이미지를 집중하는 데 도움이되는 살아있는 광학 렌즈가 포함되어 있습니다. 도 1A에 도시된 바와 같이, 렌즈는 섬세하고 복사 지향적인 섬유 시스템에 의해 광축에 매달려 있습니다. 한쪽 끝에서 섬유는 렌즈 적도에 부착하고 다른 쪽은 주모 체의 표면에 부착합니다. 그들의 길이는 마우스에 있는 150 μm에서 인간에 있는 1 mm에 구역 수색하는 거리입니다. 전체적으로, 이 섬유는 Zinn2의 구역, 섬모 구역 또는 단순히 구역으로 알려져 있습니다. 안구 외상, 질병 및 특정 유전 질환은 구역 섬유3의 무결성에 영향을 미칠 수 있으며, 이로 인해 최종 실패와 시력 상실이 발생할 수 있습니다. 마우스에서 섬유는 피브릴린-14가 풍부한 맨틀에 둘러싸여 주로 단백질 피브릴린-2로 구성된 코어를 가지고 있다. 구역 섬유는 눈에 고유하지만 신체의 다른 곳에서 발견되는 엘라스틴 기반 ECM 섬유와 많은 유사점을 지니고 있습니다. 후자는 피브릴린-1 맨틀5로 덮여 있으며 구역 섬유6과 유사한 치수를 가지고 있습니다. 잠복 변환 성장 인자 β 결합 단백질 (LTBPs) 및 마이크로 피브릴 관련 당단백질-1 (MAGP-1)와 같은 다른 단백질은 두 가지 유형의 섬유7,8,9,10,11과 관련하여 발견됩니다. 구역 섬유의 탄성 계수는 엘라스틴 기반 섬유(0.3-1.2 MPa)17과 비교할 수 있는 0.18-1.50 MPa12,13,14,15,16의 범위에 있다. 이러한 건축 및 기계적 유사성은 구역 관련 단백질의 역할에 대한 통찰력이 다른 ECM 탄성 섬유에서 자신의 역할을 해명하는 데 도움이 될 수 있다고 믿게 합니다.
여기서 설명된 방법을 개발하는 주요 목적은 상속된 눈 질환의 진행에 특정 구역 단백질의 역할에 대한 통찰력을 얻는 것입니다. 일반적인 접근은 구역 단백질을 코딩하는 유전자에 있는 표적으로 한 돌연변이를 운반하는 마우스의 그것과 야생 형 마우스에 있는 구역 섬유의 점성탄성 속성을 비교하는 것입니다. 이전에는 구역 섬유의 엘라스토-기계적 특성을 측정하기 위해 여러 가지 방법이 사용되었지만, 모두 훨씬 더 큰 동물의 눈을 위해 설계되었습니다12,13,14,15,16. 이러한 모델은 유전적으로 유전적으로 유전적으로 견딜 수 없습니다. 우리는 마우스의 작고 섬세한 눈에 더 적합한 실험 방법을 개발하기 위해 노력했습니다.
마우스 구역 섬유의 점성을 평가하기 위해 개발한 방법은 도 1에서 시각적으로 요약되는 풀업 분석4,18로 지칭하는 기술입니다. 풀업 방법과 결과의 분석에 대한 자세한 설명은 아래에 제공됩니다. 우리는 프로젝트에 사용되는 3차원 (3D) 인쇄 부품을 포함하여 장치의 건설을 설명하는 것으로 시작합니다. 다음으로, 실험을 위해 눈을 얻고 준비하는 데 사용되는 프로토콜을 자세히 설명합니다. 마지막으로, 구역 섬유의 점탄성 특성 판정을 위한 데이터를 얻는 방법에 대한 단계별 지침을 제공합니다. 대표 결과 섹션에서는 MAGP-119가 부족한 마우스로부터 구역 섬유의 점탄성 특성과 연령일치 야생형 동물로부터 얻은 대조군 세트에 대해 이전에 공개되지 않은 데이터를 공유합니다. 마지막으로, 우리는 방법의 장점과 한계에 대한 일반적인 발언과 환경 및 생화학 적 요인이 ECM 섬유의 점탄성 특성에 미치는 영향을 설명 할 수있는 잠재적 인 실험에 대한 제안으로 결론을 내립니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
구역은 섬유가 대칭으로 배열되고 광학 축을 따라 눈 렌즈를 대체하여 동일하게 조작 할 수있는 특이한 ECM 시스템입니다. 공간은 또한 세포 중단 없이 쉽게 접근할 수 있고, 섬유는 그들의 네이티브 상태에 가까운 환경에서 공부될 수 있습니다. 풀업 기법은 이 ECM 프레젠테이션을 활용하여 유전적으로 방인하는 마우스의 섬세한 섬유를 조작하고 기계적 특성을 정확하게 정량화합니다. 이를 통해 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH R01 EY01 EY029130 (S.B)과 P30 EY002687 (S.B.), R01 HL53325 및 Ines Mandl 연구 재단 (R.P.M.), 마르판 재단, 워싱턴 대학의 안과 및 시각 과학 학과에 대한 무제한 보조금에 의해 지원되었습니다. J.R.은 또한 이 프로젝트를 지원하기 위해 건강 과학 및 약학 대학에서 보조금을 받았습니다.
Materials
| 1/4-20 hex screws 3/4 inch long | Thorlabs | SH25S075 | |
| 1/4-20 nut | Hardware store | ||
| 3D SLA printer | Anycubic | Photon | |
| 4-40 screws 3/8 inch long, 2 | Hardware store | ||
| Capillaries, OD 1.2 mm and 3 inches long, no filament | WPI | 1B120-3 | |
| Cyanoacrylate (super) glue | Loctite | ||
| Digital Scale accurate to 0.01 g | Vernier | OHAUS Scout 220 | |
| Excel | Microsoft | Spreadsheet | |
| Gas cigarette lighter | |||
| Inspection/dissection microscope | Amscope | SKU: SM-4NTP | Working distance ~ 15 cm |
| Micromanipulator, Economy 4-axis | WPI | Kite-L | |
| Motorized micrometer | Thorlabs | Z812B | |
| Negative cylindrical lens | Thorlabs | LK1431L1 | -75 mm focal length |
| Petri dishes, 50 mm | |||
| Post holder, 3 inches | Thorlabs | PH3 | |
| Post, 4 inches | Thorlabs | TR4 | |
| Scale logging software | Vernier | LoggePro | |
| Servo motor controller | Thorlabs | KDC101 | |
| Servo motor controller software | Thorlabs | APT | |
| Slotted base, 1 | Thorlabs | BA1S | |
| Slotted bases, 2 | Thorlabs | BA2 | |
| Stand for micromanipular | WPI | M-10 | |
| USB-camera for microscope | Amscope | SKU: MD500 | |
| UV activated glue with UV source | Amazon |
Referências
- Bassnett, S., Shi, Y., Vrensen, G. F. Biological glass: structural determinants of eye lens transparency. Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1568), 1250-1264 (2011).
- Bassnett, S. Zinn’s zonule. Progress in Retinal and Eye Research. 82, 100902 (2021).
- Dureau, P. Pathophysiology of zonular diseases. Current Opinion in Ophthalmology. 19 (1), 27-30 (2008).
- Shi, Y., et al. Latent-transforming growth factor beta-binding protein-2 (LTBP-2) is required for longevity but not for development of zonular fibers. Matrix Biology. 95, 15-31 (2021).
- Ushiki, T. Collagen fibers, reticular fibers and elastic fibers. A comprehensive understanding from a morphological viewpoint. Archives of Histology and Cytology. 65 (2), 109-126 (2002).
- Bassnett, S. A method for preserving and visualizing the three-dimensional structure of the mouse zonule. Experimental Eye Research. 185, 107685 (2019).
- Todorovic, V., Rifkin, D. B. LTBPs, more than just an escort service. Journal of Cellular Biochemistry. 113 (2), 410-418 (2012).
- Mecham, R. P., Gibson, M. A. The microfibril-associated glycoproteins (MAGPs) and the microfibrillar niche. Matrix Biology. 47, 13-33 (2015).
- Hubmacher, D., Reinhardt, D. P., Plesec, T., Schenke-Layland, K., Apte, S. S. Human eye development is characterized by coordinated expression of fibrillin isoforms. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (12), 7934-7944 (2014).
- Inoue, T., et al. Latent TGF-β binding protein-2 is essential for the development of ciliary zonule microfibrils. Human Molecular Genetics. 23 (21), 5672-5682 (2014).
- De Maria, A., Wilmarth, P. A., David, L. L., Bassnett, S. Proteomic analysis of the bovine and human ciliary zonule. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (1), 573-585 (2017).
- Wright, D. M., Duance, V. C., Wess, T. J., Kielty, C. M., Purslow, P. P. The supramolecular organization of fibrillin-rich microfibrils determines the mechanical properties of bovine zonular filaments. Journal of Experimental Biology. 202 (21), 3011-3020 (1999).
- Bocskai, Z. I., Sandor, G. L., Kiss, Z., Bojtar, I., Nagy, Z. Z. Evaluation of the mechanical behaviour and estimation of the elastic properties of porcine zonular fibres. Journal of Biomechanics. 47 (13), 3264-3271 (2014).
- Fisher, R. F. The ciliary body in accommodation. Transactions of the Ophthalmological Societies of the United Kingdom. 105, 208-219 (1986).
- Michael, R., et al. Elastic properties of human lens zonules as a function of age in presbyopes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (10), 6109-6114 (2012).
- van Alphen, G. W., Graebel, W. P. Elasticity of tissues involved in accommodation. Vision Research. 31 (7-8), 1417-1438 (1991).
- Green, E. M., Mansfield, J. C., Bell, J. S., Winlove, C. P. The structure and micromechanics of elastic tissue. Interface Focus. 4 (2), 20130058 (2014).
- Jones, W., Rodriguez, J., Bassnett, S. Targeted deletion of fibrillin-1 in the mouse eye results in ectopia lentis and other ocular phenotypes associated with Marfan syndrome. Disease Models & Mechanisms. 12 (1), 037283 (2019).
- Weinbaum, J. S., et al. Deficiency in microfibril-associated glycoprotein-1 leads to complex phenotypes in multiple organ systems. Journal of Biological Chemistry. 283 (37), 25533-25543 (2008).
- Comeglio, P., Evans, A. L., Brice, G., Cooling, R. J., Child, A. H. Identification of FBN1 gene mutations in patients with ectopia lentis and marfanoid habitus. British Journal of Ophthalmology. 86 (12), 1359-1362 (2002).
