Una solida piattaforma di scoperta per l'identificazione di nuovi mediatori delle metastasi del melanoma
Summary
Questo articolo descrive un flusso di lavoro di tecniche impiegate per testare nuovi potenziali mediatori di metastasi del melanoma e i loro meccanismi d’azione.
Abstract
Le metastasi sono un processo complesso, che richiede alle cellule di superare barriere che sono solo modellate in modo incompleto da saggi in vitro . È stato stabilito un flusso di lavoro sistematico utilizzando modelli in vivo robusti e riproducibili e metodi standardizzati per identificare nuovi attori nelle metastasi del melanoma. Questo approccio consente l’inferenza dei dati in specifiche fasi sperimentali per caratterizzare con precisione il ruolo di un gene nelle metastasi. I modelli vengono stabiliti introducendo cellule di melanoma geneticamente modificate tramite iniezioni intracardiache, intradermiche o sottocutanee nei topi, seguite dal monitoraggio con imaging seriale in vivo . Una volta raggiunti gli endpoint prestabiliti, i tumori primari e/o gli organi portatori di metastasi vengono prelevati ed elaborati per varie analisi. Le cellule tumorali possono essere ordinate e sottoposte a una qualsiasi delle diverse piattaforme “omiche”, incluso il sequenziamento dell’RNA a singola cellula. Gli organi vengono sottoposti ad imaging e analisi immunoistopatologiche per quantificare il carico complessivo delle metastasi e mappare la loro specifica posizione anatomica. Questa pipeline ottimizzata, compresi i protocolli standardizzati per l’attecchimento, il monitoraggio, la raccolta dei tessuti, l’elaborazione e l’analisi, può essere adottata per colture derivate dal paziente, a breve termine e linee cellulari umane e murine consolidate di vari tipi di cancro solido.
Introduction
L’elevata mortalità associata al melanoma metastatico combinata con una crescente incidenza di melanoma in tutto il mondo1 (un aumento stimato del 7,86% entro il 2025) richiede nuovi approcci terapeutici. I progressi nella scoperta del target dipendono da modelli riproducibili di metastasi, un processo altamente complesso. Durante le fasi della cascata metastatica, le cellule di melanoma devono superare innumerevoli barriere per raggiungere l’evasione del sistema immunitario e la colonizzazione di tessuti distanti2. La resilienza e l’adattabilità delle cellule di melanoma derivano da una moltitudine di fattori, tra cui il loro elevato carico genetico mutazionale3 e la loro origine della cresta neurale, che conferiscono plasticità fenotipica cruciale 3,4,5. Ad ogni fase, i programmi trascrizionali consentono alle cellule di melanoma metastatizzante di passare da uno stato all’altro in base a segnali provenienti dalla diafonia con il microambiente, comprendente il sistema immunitario6, l’ambiente extracellulare 7,8 e l’architettura cellulare delle barriere fisiche9 con cui entrano in contatto. Ad esempio, le cellule di melanoma sfuggono alla sorveglianza immunitaria sottoregolando l’espressione di importanti fattori secreti dal tumore immuno-priming6.
Gli studi descrivono una “nicchia premetastatica”, in cui le cellule di melanoma secernono chemochine e citochine per innescare l’organo “bersaglio” distante per le metastasi10. Questi risultati sollevano importanti domande sul tropismo d’organo delle cellule di melanoma metastatico e sul percorso anatomico che intraprendono per accedere a tessuti distanti. Dopo l’intravaso, è noto che le cellule di melanoma metastatizzano attraverso i linfatici (diffusione linfatica) e i vasi sanguigni (diffusione ematogena)2,11. Mentre la maggior parte dei pazienti presenta una malattia localizzata, un piccolo sottogruppo di casi presenta una malattia metastatica a distanza e nessuna disseminazione linfatica (coinvolgimento linfonodale negativo)11, suggerendo l’esistenza di percorsi metastatici alternativi per il melanoma.
Quando colonizzano un sito metastatico, le cellule di melanoma subiscono adattamenti epigenetici e metabolici12,13. Per accedere e invadere nuovi compartimenti, le cellule di melanoma impiegano proteasi14 e modificazioni citoscheletriche 11,15, che consentono loro di attraversare e crescere nella loro nuova posizione. La difficoltà nel colpire le cellule di melanoma risiede nella complessità e nel numero di tali adattamenti; pertanto, il campo dovrebbe fare sforzi per ricreare sperimentalmente il maggior numero possibile di passaggi e adattamenti. Nonostante i numerosi progressi nei saggi in vitro come gli organoidi e le colture 3D16,17, questi modelli ricapitolano solo in modo incompleto la cascata metastatica in vivo.
I modelli murini hanno dimostrato valore trovando un equilibrio tra riproducibilità, fattibilità tecnica e simulazione della malattia umana. Cellule di melanoma impiantate per via intravascolare, ortotopica ed eterotopica da xenotrapianti derivati dal paziente o colture a breve termine in topi immunocompromessi o umanizzati rappresentano la spina dorsale della scoperta del bersaglio nel melanoma metastatico. Tuttavia, questi sistemi spesso mancano di un vincolo biologico cruciale sulle metastasi: il sistema immunitario. I modelli di metastasi del melanoma singenico che possiedono questo vincolo sono relativamente scarsi sul campo. Questi sistemi, sviluppati in topi immunocompetenti, tra cui B16-F1018, la famiglia YUMM di linee cellulari19, SM120, D4M321, RIM322 o più recentemente, RMS 23 e M1 (Mel114433), M3 (HCmel1274), M4 (B2905)24 linee cellulari di melanoma, facilitano lo studio del complesso ruolo della risposta immunitaria dell’ospite nella progressione del melanoma.
Qui, viene presentata una pipeline per l’identificazione del bersaglio delle metastasi del melanoma. Con l’aumento e più grandi set di dati “omici” generati da coorti di pazienti affetti da melanoma, postuliamo che gli studi che detengono la maggiore promessa clinica siano quelli che derivano dall’integrazione dei big data, portando a un meticoloso interrogatorio funzionale e meccanicistico 25,26,27,28. Utilizzando modelli murini per studiare potenziali bersagli nel processo metastatico, si possono tenere conto di eventi specifici in vivo e interazioni tissutali, aumentando così la probabilità di traduzione clinica. Sono delineati diversi metodi per quantificare il carico metastatico, fornendo dati complementari sui risultati di un dato esperimento. Viene descritto un protocollo per l’isolamento unicellulare dai tumori in vari organi per aiutare la caratterizzazione imparziale dell’espressione genica nelle cellule metastatiche, che può precedere il sequenziamento dell’RNA monocellulare o di massa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lo scopo di questo rapporto tecnico è quello di offrire un flusso di lavoro standardizzato, dall’alto verso il basso per lo studio di potenziali attori nelle metastasi del melanoma. Poiché gli esperimenti in vivo possono essere costosi e dispendiosi in termini di tempo, le strategie per massimizzare l’efficienza e aumentare il valore delle informazioni ottenute sono fondamentali.
È imperativo utilizzare approcci complementari per incrociare i risultati all’interno dello stesso espe…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo la Division of Advanced Research Technologies (DART) della NYU Langone Health, e in particolare, il Experimental Pathology Research Laboratory, il Genome Technology Center, il Cytometry and Cell Sorting Laboratory, Pre-Clinical Imaging Core, che sono parzialmente supportati dal Perlmutter Cancer Center Support Grant NIH/NCI 5P30CA016087. Ringraziamo il NYU Interdisciplinary Melanoma Cooperative Group (PI: Dr. Iman Osman) per aver fornito l’accesso alle colture a breve termine di melanoma derivate dal paziente + (10-230BM e 12-273BM), che sono state ottenute attraverso protocolli approvati dall’IRB (Universal Consent study #s16-00122 e Interdisciplinary Melanoma Cooperative Group study #10362). Ringraziamo il Dr. Robert Kerbel (Università di Toronto) per aver fornito le linee cellulari di melanoma 113/6-4L e 131/4-5B1* e il Dr. Meenhard Herlyn (Wistar Institute) per aver fornito colture a breve termine di melanoma WM 4265-2, WM 4257s-1, WM 4257-2**. E.H. è supportato da NIH/NCI R01CA243446, P01CA206980, un American Cancer Society-Melanoma Research Alliance Team Science Award e un NIH Melanoma SPORE (NCI P50 CA225450; PI: I.O.). La Figura 1 è stata creata con Biorender.com.
Materials
| #15 Scapel Blade | WPI | 500242 | For surgical procedures |
| #3 Scapel Handle | WPI | 500236 | For surgical procedures |
| 1 mL Tuberculin syringe, slip tip | BD | 309626 | Injections |
| 10 mL syringe, slip tip | BD | 301029 | Perfusion |
| 10% Formalin Sodium Buffered | EK Industries | 4499-20L | For perfusion/tissue fixative |
| 15 mL Conical | Corning | 430052 | Cell culture |
| 15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tubes | Falcon | 352196 | Cell culture |
| 200 Proof Ethanol | Deacon Labs | 04-355-223 | Histology |
| 22G – 22mm needle | BD | 305156 | Perfusion |
| 4-0 Vicryl Suture | Ethicon | J464G | Suture |
| 4% Carson's phosphate buffered paraformaldehyde | EMS | 15733-10 | For perfusion/tissue fixative |
| 40µm | Corning | 431750 | Tissue processing |
| 5-0 Absorbable Suture | Ethicon | 6542000 | Closure |
| 50 mL Conical | Corning | 430828 | Cell culture |
| 50mL Conical Polypropylene Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | Cell culture |
| 7-0 Silk suture | FST | 18020-70 | Ligature |
| 70µm | Corning | 431751 | Tissue processing |
| Anti-fade mounting media | Vector Labs | H-1000-10 | Immunofluorescence |
| Approximator applying Forceps, 10cm | WPI | 14189 | For microsurgical procedures |
| Avance | Bruker | 3 HD | NMR Console |
| Biospec 7030 | Bruker | 7030 | Micro MRI |
| BSA | Bioreg | A941 | NuMA Staining |
| Castroviejo suturing forceps, straight tips 5.5mm tying platform, 11cm | WPI | WP5025501 | For microsurgical procedures |
| Coplin Staining Jar | Bel-Art | F44208-1000 | Histology |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Immunofluorescence |
| dCas9-KRAB | Addgene | 110820 | Genetic manipulation |
| DNase I | NEB | M0303L | Tissue processing |
| DPBS | Corning | 21-030-CM | Tissue processing |
| Extra Sharp Uncoated Single Edge Blade | GEM | 62-0167 | Tissue processing |
| Extracellular Matrix Substrate | Corning | 354234 | Consider the Growth Factor Reduced ( as alternative |
| FBS | Cytiva | SH30910.03 | Cell culture |
| Fiji Image J | Fiji Image J | Software | Immunofluorescence |
| Goat anti-rabbit HRP conjugated multimer | Thermo Fisher | A16104 | NuMA Staining |
| Goat Serum | Gibco | PCN5000 | Immunofluorescence |
| HBSS | Corning | 21-020-CV | Tissue processing |
| Hematoxylin | Richard-Allan Scientific | 7231 | Histology |
| Illumina III | PerkinElmer | CLS136334 | BLI Instrument |
| Insulin syringe 28G – 8mm needle | BD | 329424 | Injections |
| Insulin syringe 31G – 6mm needle | BD | 326730 | Injections |
| Iris Forceps, 10.2cm, Full Curve, serrated | WPI | 504478 | For perfusion and surgical procedures |
| Isoflurane USP | Covetrus | 11695067772 | Anesthesia |
| Jewelers #7 Forceps Titanium 11 cm 0.07 x 0.01 mm Tip | WPI | WP6570 | For microsurgical procedures |
| Ketamine HCl 100mg/mL | Mylan Ind. | 1049007 | Anesthesia |
| lentiCRISPRv2 | Addgene | 98290 | Genetic manipulation |
| Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin, DyLight 649 | Invitrogen | L32472 | Vascular endothelial cells marker |
| MEM non-essential amino acids X 100 | Corning | 25-025-CI | Cell culture |
| Metzenbaum Scissors | WPI | 503269 | For surgical procedures |
| Microinjection Unit | KOPF | 5000 | Intracardiac injections |
| NaCl | Fisher | S25877 | NuMA Staining |
| Needle 30G x 25mm | BD | 305128 | Intracardiac Injection |
| Needle 33G x 15mm | Hamilton | 7747-01 | Intracarotid Injection |
| Needle holder, Castroviejo, 14cm, with lock, 1.2mm Serrated Jaws | WPI | 14137-G | For microsurgical procedures |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ mice | The Jackson Laboratory | 005557 | Murine model |
| NU/J mice | The Jackson Laboratory | 002019 | Murine model |
| Nuclear Mitotic Apparatus Protein polyclonal rabbit anti-human | Abcam | 97585 | NuMA Staining |
| Penicillin-Streptomycin 10000U/mL | Gibco | 15140122 | Cell culture |
| Percoll | GE | 0891-01 | density separation solution |
| PI Classic Surgical Gloves | Cardinal Health | 2D72PT75X | Surgery |
| pLKO Tet-On | Addgene | 21915 | Genetic manipulation |
| Povidone-Iodine 10% Solution | Medline | MDS093943 | Surgery |
| Proparacaine Drops 0.5% | Akorn Pharma | AX0501 | Opthalmic local anesthetic |
| Puralube Petrolatum Opthalmic Ointment | Dechra | 83592 | Anesthesia |
| Razor Blade Double Edge Blades | EMS | 72000 | Shaving and Vibrotome Brain Slicing |
| Reflex 9mm EZ Clip | Braintree | EZC- KIT | Wound closure |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CM | Cell culture |
| Scissors, Spring 10.5cm Str, 8mm Blades | WPI | 501235 | For microsurgical procedures |
| Semi-Automatic Vibrating Blade Microtome | Leica | VT1200 | Brain Slice Immunofluorescence |
| Single Channel Anesthesia Vaporizer System | Kent Scientific | VetFlo-1210S | Anesthesia |
| Smartbox Tabletop Chamber System and Exhaust Blower | EZ Systems | TT4000 | CO2 Euthanasia |
| Sterile Fenestrated Disposable Drape | Medline | NON21002 | Surgery |
| Sterile Non-Reinforced Aurora Surgical Gowns with Set-In Sleeves | Medline | DYNJP2715 | Surgery |
| T25 Flask | Corning | 430639 | Cell culture |
| Tris | Corning | 46-031-CM | NuMA Staining |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | Immunofluorescence |
| Troutman tying forceps, 10cm, Curved G pattern, 0.52mm tip with tying platform | WPI | WP505210 | For microsurgical procedures |
| Vessel clips 10G Pressure 5x 0.8mm Jaws, 5/pkg | WPI | 15911 | For microsurgical procedures |
| Visiopharm | Visiopharm | Visiopharm | NuMA Staining Quantification Software |
| Xylasine 100mg/mL | Akorn Pharma | 59399-111-50 | Anesthesia |
| Xylene | Fisher | X3P-1GAL | Histology |
Referências
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