Una plataforma de descubrimiento robusta para la identificación de nuevos mediadores de la metástasis del melanoma
Summary
Este artículo describe un flujo de trabajo de técnicas empleadas para probar nuevos mediadores candidatos de metástasis de melanoma y sus mecanismos de acción.
Abstract
La metástasis es un proceso complejo que requiere que las células superen barreras que solo se modelan de manera incompleta mediante ensayos in vitro . Se estableció un flujo de trabajo sistemático utilizando modelos in vivo robustos y reproducibles y métodos estandarizados para identificar nuevos actores en la metástasis del melanoma. Este enfoque permite la inferencia de datos en etapas experimentales específicas para caracterizar con precisión el papel de un gen en la metástasis. Los modelos se establecen mediante la introducción de células de melanoma modificadas genéticamente a través de inyecciones intracardíacas, intradérmicas o subcutáneas en ratones, seguidas de monitoreo con imágenes seriales in vivo . Una vez que se alcanzan los criterios de valoración preestablecidos, los tumores primarios y / o los órganos portadores de metástasis se extraen y procesan para diversos análisis. Las células tumorales se pueden clasificar y someter a cualquiera de varias plataformas “ómicas”, incluida la secuenciación de ARN unicelular. Los órganos se someten a análisis de imagen e inmunohistopatológicos para cuantificar la carga general de metástasis y mapear su ubicación anatómica específica. Esta tubería optimizada, que incluye protocolos estandarizados para el injerto, monitoreo, recolección de tejidos, procesamiento y análisis, se puede adoptar para cultivos a corto plazo derivados de pacientes y líneas celulares humanas y murinas establecidas de varios tipos de cáncer sólido.
Introduction
La alta mortalidad asociada con el melanoma metastásico combinada con una incidencia creciente de melanoma en todo el mundo1 (un aumento estimado del 7,86% para 2025) requiere nuevos enfoques de tratamiento. Los avances en el descubrimiento de objetivos dependen de modelos reproducibles de metástasis, un proceso altamente complejo. A lo largo de los pasos de la cascada metastásica, las células de melanoma deben superar innumerables barreras para lograr la evasión del sistema inmune y la colonización de tejidos distantes2. La resiliencia y adaptabilidad de las células de melanoma surgen de multitud de factores, entre ellos su elevada carga mutacional genética3 y su origen en la cresta neural, que confieren una plasticidad fenotípica crucial 3,4,5. En cada paso, los programas transcripcionales permiten que las células de melanoma en metástasis cambien de un estado a otro en función de las señales de la diafonía con el microambiente, que comprende el sistema inmune6, el medio extracelular 7,8 y la arquitectura celular de las barreras físicas9 con las que entran en contacto. Por ejemplo, las células de melanoma escapan a la vigilancia inmune al regular a la baja la expresión de importantes factores secretos por tumores inmunocebadores6.
Los estudios describen un “nicho premetastático”, en el que las células de melanoma secretan quimiocinas y citoquinas para preparar el órgano “objetivo” distante para la metástasis10. Estos hallazgos plantean preguntas importantes sobre el tropismo de los órganos de las células de melanoma metastásico y la ruta anatómica que toman para acceder a tejidos distantes. Después de la intravasación, se sabe que las células de melanoma hacen metástasis a través de los linfáticos (diseminación linfática) y los vasos sanguíneos (diseminación hematógena)2,11. Si bien la mayoría de los pacientes presentan enfermedad localizada, un pequeño subconjunto de casos se presenta con enfermedad metastásica a distancia y sin diseminación linfática (afectación negativa de los ganglios linfáticos)11, lo que sugiere la existencia de vías metastásicas alternativas para el melanoma.
Cuando colonizan un sitio metastásico, las células de melanoma experimentan adaptaciones epigenéticas y metabólicas12,13. Para acceder e invadir nuevos compartimentos, las células de melanoma emplean proteasas14 y modificaciones citoesqueléticas 11,15, que les permiten atravesar y crecer en su nueva ubicación. La dificultad para atacar las células de melanoma reside en la complejidad y el número de tales adaptaciones; por lo tanto, el campo debe hacer esfuerzos para recrear experimentalmente tantos pasos y adaptaciones como sea posible. A pesar de los numerosos avances en ensayos in vitro como organoides y cultivos 3D16,17, estos modelos solo recapitulan incompletamente la cascada metastásica in vivo.
Los modelos murinos han demostrado valor al lograr un equilibrio entre la reproducibilidad, la viabilidad técnica y la simulación de enfermedades humanas. Las células de melanoma implantadas intravascular, ortotópica y heterotópicamente a partir de xenoinjertos derivados del paciente o cultivos a corto plazo en ratones inmunocomprometidos o humanizados representan la columna vertebral del descubrimiento de dianas en el melanoma metastásico. Sin embargo, estos sistemas a menudo carecen de una restricción biológica crucial en la metástasis: el sistema inmunológico. Los modelos de metástasis de melanoma singénico que poseen esta restricción son relativamente escasos en el campo. Estos sistemas, desarrollados en ratones inmunocompetentes, incluyendo B16-F1018, la familia YUMM de líneascelulares 19, SM120, D4M321, RIM322 o más recientemente, las líneas celulares de melanoma RMS23 y M1 (Mel114433), M3 (HCmel1274), M4 (B2905)24 , facilitan la investigación del complejo papel de la respuesta inmune del huésped en la progresión del melanoma.
Aquí, se presenta una tubería para la identificación del objetivo de metástasis de melanoma. Con el aumento y la generación de conjuntos de datos ómicos a partir de cohortes de pacientes con melanoma, postulamos que los estudios que tienen la promesa más clínica son los que se derivan de la integración de big data, lo que lleva a un meticuloso interrogatorio funcional y mecanicista 25,26,27,28. Mediante el uso de modelos de ratón para estudiar objetivos potenciales en el proceso metastásico, se pueden tener en cuenta los eventos específicos in vivo y las interacciones tisulares, lo que aumenta la probabilidad de traducción clínica. Se describen múltiples métodos para cuantificar la carga metastásica, proporcionando datos complementarios sobre los resultados de cualquier experimento dado. Se describe un protocolo para el aislamiento unicelular de tumores en varios órganos para ayudar a la caracterización imparcial de la expresión génica en células metastásicas, que puede preceder a la secuenciación de ARN unicelular o a granel.
Protocol
Representative Results
Discussion
El objetivo de este informe técnico es ofrecer un flujo de trabajo estandarizado de arriba a abajo para la investigación de actores potenciales en la metástasis del melanoma. Como los experimentos in vivo pueden ser costosos y llevar mucho tiempo, las estrategias para maximizar la eficiencia y aumentar el valor de la información obtenida son primordiales.
Es imperativo utilizar enfoques complementarios para validar los hallazgos dentro del mismo experimento. Por ejemplo, tanto la …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a la División de Tecnologías de Investigación Avanzada (DART) de NYU Langone Health, y en particular, al Laboratorio de Investigación de Patología Experimental, el Centro de Tecnología del Genoma, el Laboratorio de Citometría y Clasificación Celular, el Núcleo de Imágenes Preclínicas, que cuentan con el apoyo parcial de la Subvención de Apoyo del Centro de Cáncer Perlmutter NIH / NCI 5P30CA016087. Agradecemos al NYU Interdisciplinary Melanoma Cooperative Group (PI: Dr. Iman Osman) por proporcionar acceso a cultivos a corto plazo de melanoma derivado de pacientes + (10-230BM y 12-273BM), que se obtuvieron a través de protocolos aprobados por IRB (estudio de consentimiento universal #s16-00122 y estudio del Grupo Cooperativo interdisciplinario de melanoma # 10362). Agradecemos al Dr. Robert Kerbel (Universidad de Toronto) por proporcionar líneas celulares de melanoma 113/6-4L y 131/4-5B1* y al Dr. Meenhard Herlyn (Instituto Wistar) por proporcionar cultivos a corto plazo de melanoma WM 4265-2, WM 4257s-1, WM 4257-2*. E.H. cuenta con el apoyo de NIH/NCI R01CA243446, P01CA206980, un Premio científico del equipo de la American Cancer Society-Melanoma Research Alliance y una ESPORA de melanoma de los NIH (NCI P50 CA225450; PI: I.O.). La figura 1 se creó con Biorender.com.
Materials
| #15 Scapel Blade | WPI | 500242 | For surgical procedures |
| #3 Scapel Handle | WPI | 500236 | For surgical procedures |
| 1 mL Tuberculin syringe, slip tip | BD | 309626 | Injections |
| 10 mL syringe, slip tip | BD | 301029 | Perfusion |
| 10% Formalin Sodium Buffered | EK Industries | 4499-20L | For perfusion/tissue fixative |
| 15 mL Conical | Corning | 430052 | Cell culture |
| 15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tubes | Falcon | 352196 | Cell culture |
| 200 Proof Ethanol | Deacon Labs | 04-355-223 | Histology |
| 22G – 22mm needle | BD | 305156 | Perfusion |
| 4-0 Vicryl Suture | Ethicon | J464G | Suture |
| 4% Carson's phosphate buffered paraformaldehyde | EMS | 15733-10 | For perfusion/tissue fixative |
| 40µm | Corning | 431750 | Tissue processing |
| 5-0 Absorbable Suture | Ethicon | 6542000 | Closure |
| 50 mL Conical | Corning | 430828 | Cell culture |
| 50mL Conical Polypropylene Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | Cell culture |
| 7-0 Silk suture | FST | 18020-70 | Ligature |
| 70µm | Corning | 431751 | Tissue processing |
| Anti-fade mounting media | Vector Labs | H-1000-10 | Immunofluorescence |
| Approximator applying Forceps, 10cm | WPI | 14189 | For microsurgical procedures |
| Avance | Bruker | 3 HD | NMR Console |
| Biospec 7030 | Bruker | 7030 | Micro MRI |
| BSA | Bioreg | A941 | NuMA Staining |
| Castroviejo suturing forceps, straight tips 5.5mm tying platform, 11cm | WPI | WP5025501 | For microsurgical procedures |
| Coplin Staining Jar | Bel-Art | F44208-1000 | Histology |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Immunofluorescence |
| dCas9-KRAB | Addgene | 110820 | Genetic manipulation |
| DNase I | NEB | M0303L | Tissue processing |
| DPBS | Corning | 21-030-CM | Tissue processing |
| Extra Sharp Uncoated Single Edge Blade | GEM | 62-0167 | Tissue processing |
| Extracellular Matrix Substrate | Corning | 354234 | Consider the Growth Factor Reduced ( as alternative |
| FBS | Cytiva | SH30910.03 | Cell culture |
| Fiji Image J | Fiji Image J | Software | Immunofluorescence |
| Goat anti-rabbit HRP conjugated multimer | Thermo Fisher | A16104 | NuMA Staining |
| Goat Serum | Gibco | PCN5000 | Immunofluorescence |
| HBSS | Corning | 21-020-CV | Tissue processing |
| Hematoxylin | Richard-Allan Scientific | 7231 | Histology |
| Illumina III | PerkinElmer | CLS136334 | BLI Instrument |
| Insulin syringe 28G – 8mm needle | BD | 329424 | Injections |
| Insulin syringe 31G – 6mm needle | BD | 326730 | Injections |
| Iris Forceps, 10.2cm, Full Curve, serrated | WPI | 504478 | For perfusion and surgical procedures |
| Isoflurane USP | Covetrus | 11695067772 | Anesthesia |
| Jewelers #7 Forceps Titanium 11 cm 0.07 x 0.01 mm Tip | WPI | WP6570 | For microsurgical procedures |
| Ketamine HCl 100mg/mL | Mylan Ind. | 1049007 | Anesthesia |
| lentiCRISPRv2 | Addgene | 98290 | Genetic manipulation |
| Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin, DyLight 649 | Invitrogen | L32472 | Vascular endothelial cells marker |
| MEM non-essential amino acids X 100 | Corning | 25-025-CI | Cell culture |
| Metzenbaum Scissors | WPI | 503269 | For surgical procedures |
| Microinjection Unit | KOPF | 5000 | Intracardiac injections |
| NaCl | Fisher | S25877 | NuMA Staining |
| Needle 30G x 25mm | BD | 305128 | Intracardiac Injection |
| Needle 33G x 15mm | Hamilton | 7747-01 | Intracarotid Injection |
| Needle holder, Castroviejo, 14cm, with lock, 1.2mm Serrated Jaws | WPI | 14137-G | For microsurgical procedures |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ mice | The Jackson Laboratory | 005557 | Murine model |
| NU/J mice | The Jackson Laboratory | 002019 | Murine model |
| Nuclear Mitotic Apparatus Protein polyclonal rabbit anti-human | Abcam | 97585 | NuMA Staining |
| Penicillin-Streptomycin 10000U/mL | Gibco | 15140122 | Cell culture |
| Percoll | GE | 0891-01 | density separation solution |
| PI Classic Surgical Gloves | Cardinal Health | 2D72PT75X | Surgery |
| pLKO Tet-On | Addgene | 21915 | Genetic manipulation |
| Povidone-Iodine 10% Solution | Medline | MDS093943 | Surgery |
| Proparacaine Drops 0.5% | Akorn Pharma | AX0501 | Opthalmic local anesthetic |
| Puralube Petrolatum Opthalmic Ointment | Dechra | 83592 | Anesthesia |
| Razor Blade Double Edge Blades | EMS | 72000 | Shaving and Vibrotome Brain Slicing |
| Reflex 9mm EZ Clip | Braintree | EZC- KIT | Wound closure |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CM | Cell culture |
| Scissors, Spring 10.5cm Str, 8mm Blades | WPI | 501235 | For microsurgical procedures |
| Semi-Automatic Vibrating Blade Microtome | Leica | VT1200 | Brain Slice Immunofluorescence |
| Single Channel Anesthesia Vaporizer System | Kent Scientific | VetFlo-1210S | Anesthesia |
| Smartbox Tabletop Chamber System and Exhaust Blower | EZ Systems | TT4000 | CO2 Euthanasia |
| Sterile Fenestrated Disposable Drape | Medline | NON21002 | Surgery |
| Sterile Non-Reinforced Aurora Surgical Gowns with Set-In Sleeves | Medline | DYNJP2715 | Surgery |
| T25 Flask | Corning | 430639 | Cell culture |
| Tris | Corning | 46-031-CM | NuMA Staining |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | Immunofluorescence |
| Troutman tying forceps, 10cm, Curved G pattern, 0.52mm tip with tying platform | WPI | WP505210 | For microsurgical procedures |
| Vessel clips 10G Pressure 5x 0.8mm Jaws, 5/pkg | WPI | 15911 | For microsurgical procedures |
| Visiopharm | Visiopharm | Visiopharm | NuMA Staining Quantification Software |
| Xylasine 100mg/mL | Akorn Pharma | 59399-111-50 | Anesthesia |
| Xylene | Fisher | X3P-1GAL | Histology |
Referências
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