Summary
El presente protocolo describe el aislamiento agudo de células viables del músculo liso cardíaco y vascular de peces cebra adultos, juveniles, larvales y embrionarios (Danio rerio), adecuados para estudios electrofisiológicos.
Abstract
El pez cebra se ha utilizado durante mucho tiempo como organismo vertebrado modelo en la investigación cardiovascular. Las dificultades técnicas de aislar células individuales de los tejidos cardiovasculares del pez cebra han sido limitantes en el estudio de sus propiedades electrofisiológicas. Se han descrito métodos anteriores para la disección de corazones de pez cebra y el aislamiento de miocitos cardíacos ventriculares. Sin embargo, no se detalló el aislamiento de miocitos auriculares y vasculares del pez cebra para la caracterización electrofisiológica. Este trabajo describe protocolos enzimáticos nuevos y modificados que proporcionan rutinariamente cardiomiocitos ventriculares y auriculares aislados de pez cebra juveniles y adultos, así como células de músculo liso vascular (VSM) de la arteria bulbosa, adecuadas para experimentos de patch-clamp. No ha habido evidencia literaria de estudios electrofisiológicos en tejidos cardiovasculares de pez cebra aislados en etapas embrionarias y larvales de desarrollo. Se demuestran técnicas de disociación parcial que permiten experimentos de patch-clamp en células individuales de corazones larvales y embrionarios.
Introduction
El pez cebra son pequeños peces teleósteos que se han utilizado durante mucho tiempo como organismo vertebrado modelo1 y recientemente han llegado a la prominencia como un sistema de vertebrados viable para el cribado de genes y fármacos de alto rendimiento 2,3. Sin embargo, el análisis fisiológico de los tejidos del pez cebra no está bien desarrollado. En el sistema cardiovascular, se han descrito métodos para la disección de corazones de pez cebra4 y el aislamiento de miocitos cardíacos ventriculares 5,6,7. Hay pocas descripciones detalladas del aislamiento efectivo de los miocitos auriculares y no hay informes de preparaciones de músculo liso vascular (VSM) para estudios de patch-clamp.
El presente trabajo describe la metodología para el aislamiento de miocitos cardíacos y vasculares del pez cebra, viable para estudios electrofisiológicos y funcionales. Este enfoque incluye modificaciones de protocolos previamente reportados para el aislamiento de miocitos ventriculares del pez cebra5,6 y adapta los métodos de los aislamientos de células VSM de mamíferos8, permitiendo el aislamiento de las células del músculo liso vascular del pez cebra de la arteriosa bulbosa (BA). Los protocolos dan como resultado rendimientos eficientes de células aisladas de atrial, ventricular y VSM del pez cebra que se pueden usar de manera confiable en estudios de parche y pinza hasta 8 h9.
A pesar de sus larvas casi transparentes que se desarrollan completamente fuera del organismo parental, la exploración de su potencial ontogenético prometido en el estudio del desarrollo cardiovascular se ha visto limitada por los desafíos en la extracción y el análisis de tejidos a una edad temprana. El presente artículo aborda esta limitación mediante la demostración de experimentos de patch-clamp en corazones de pez cebra aislados tan pronto como 3 días después de la fertilización (dpf), utilizando un método de extracción adaptado y publicado10.
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Protocol
Todos los peces cebra (cepa de tipo salvaje AB, tanto machos como hembras) fueron criados, mantenidos y manejados para los experimentos siguiendo las pautas del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Washington (IACUC).
1. Aislamiento de la aurícula, el ventrículo y la arteriosa bulbosa del pez cebra adulto, juvenil y larval
- Eutanasia de peces usando choque frío, es decir, sumergiéndolos en agua a 4 °C, durante ~10 s.
- Usando pinzas curvas, transfiera los peces a una placa de Petri grande parcialmente llena de tampón de perfusión (PB) (Tabla 1) y colóquelos bajo un microscopio de disección.
- Decapitar el pez justo después de los ojos, usando un par de tijeras.
- Usando pinzas curvas (pinzas finas para peces larvales), sostenga a los peces en la mano no dominante con el lado ventral hacia el alcance de disección. Con el segundo par de pinzas finas (o superfinas para peces larvales) en la mano dominante, abra suavemente los músculos pectorales y las aletas para revelar los tejidos cardiovasculares (CV) (aurícula, ventrículo y arteriosa bulbosa, BA) (Figura 1).
- Colocando las pinzas finas en la mano dominante, tire suavemente del BA en la punta de intersección del BA y la aorta ventral.
NOTA: El BA y el corazón saldrán de la cavidad corporal.- Separe cuidadosamente el BA de la aorta pellizcando los fórceps y ubicando la punta de la aurícula en la que convergen múltiples ramas venosas (seno venoso). Usando los fórceps finos, "arranca" la punta de la aurícula del seno venoso. Esto aísla los tejidos CV del resto del cuerpo (Figura 1).
2. Disociación de cardiomiocitos de peces cebra adultos, juveniles y larvales para estudios electrofisiológicos
- Usando los fórceps finos, "arrancar" la aurícula y el ventrículo del tejido CV aislado en el paso anterior.
NOTA: El proceso permite una disección limpia de cada tejido con una contaminación cruzada mínima y se siente como arrancar fruta de un árbol.- Haga un desgarro suave en el ventrículo con fórceps finos para drenar el exceso de sangre, lo que se puede garantizar cuando el tejido cardíaco se vuelve de color salmón pálido de rojo brillante.
- Agrupar la aurícula y el ventrículo aislados en tubos centrífugos separados de 1,5 ml que contengan tampón de perfusión (PB; 1,5 ml).
NOTA: Para garantizar la disociación exitosa de los cardiomiocitos auriculares adultos (ACM) y los cardiomiocitos ventriculares (VCM), generalmente se necesitan cuatro aurículas y tres ventrículos. En el caso del pez cebra juvenil (28-90 días), este número se duplica.- En el caso de larvas de pez cebra (14-28 días), recolecte la mayor cantidad de tejido posible de ~ 30 larvas.
- Reemplace el PB en los tubos con 750 μL de tampón de digestión (DB) (Tabla 1) cada uno y coloque los tubos en un termoagitador a 37 °C y 800 rpm. Permita la digestión de los tejidos hasta que se vuelvan translúcidos (~ 30 min para las aurículas y ~ 40 min para los ventrículos).
- Termine la digestión girando suavemente los tejidos en una mini centrífuga de sobremesa (2,000 x g a temperatura ambiente) durante 3-5 s y reemplace el sobrenadante DB con 750 μL de tampón de parada (SB) cada uno (Tabla 1).
NOTA: Este paso de centrifugación es opcional para el aislamiento VCM. - Incubar los tejidos peletizados en el SB a temperatura ambiente durante 15 min.
- Reemplace suavemente el SB con 500-750 μL de PB cada uno (dependiendo de la densidad deseada de las células finales) y triture los tejidos (~ 30 veces) usando una pipeta Pasteur pulida a la llama para dispersar las células.
NOTA: Los cardiomiocitos (CM) ya están listos para estudios electrofisiológicos y se almacenan a temperatura ambiente durante un máximo de 8 h. - Para un muestreo uniforme, pipetear suavemente las células hacia arriba y hacia abajo un par de veces para resuspenderlas antes de agregar una gota de ellas para los estudios correspondientes.
3. Disociación de células del músculo liso vascular (VSM) de peces cebra adultos y juveniles para estudios electrofisiológicos
- Extraer la arteriosa bulbosa (BA) de los tejidos CV utilizando el mismo enfoque que el paso 2.1 y agrupar cinco BA adultos en un tubo centrífugo de 1,5 ml que contenga tampón S1 (1,5 ml) (Tabla 2). En el caso de los peces cebra juveniles, agrupar diez BA y, para larvas de más de 2 semanas, agrupar 30-40 BA.
NOTA: No es prácticamente factible aislar células VSM de larvas de pez cebra menores de 2 semanas. - Reemplace S1 con 400 μL de tampón S2 (Tabla 2) y permita la digestión de la papaína (consulte la Tabla de materiales) de los BA en un termoagitador a 37 °C y 800 rpm durante ~20 min.
- Deje que los BA parcialmente digeridos se asienten durante 1 minuto y reemplace el sobrenadante S2 con 500 μL de tampón S3 (Tabla 2) que contiene colagenasa. Digerir los tejidos en un termoagitador a 37 °C y 800 rpm durante 3-5 min.
- Termine la digestión girando suavemente los tejidos en una mini centrífuga de sobremesa (2,000 x g a temperatura ambiente) durante 3-5 s y reemplazando el sobrenadante S3 con 500 μL de S1.
- Triture suavemente los tejidos granulados (~ 15 veces) para dispersar las células VSM y coloque en cubreobjetos de vidrio del tamaño adecuado.
NOTA: El tamaño del cubreobjetos está determinado por el tamaño de la cámara de grabación de la abrazadera de parche, en este caso, se utilizó 5 x 5 mm).- Mantenga los cubreobjetos a temperatura ambiente durante 30 minutos para que las células se adhieran y úselos dentro de las próximas 6 h.
4. Aislamiento de corazones de peces cebra embrionarios para estudios electrofisiológicos
- Añadir tricaína (150 mg/L; 1 ml por placa de Petri de 100 mm x 20 mm) a ~300 embriones (2-5 dpf), recogidos de sus condiciones de incubación (Figura 2A).
- Concentrar los embriones anestesiados transfiriéndolos a un tubo de centrífuga de 5 ml utilizando una pipeta de transferencia, eliminando el exceso de medios (E3) del tubo de centrífuga (Figura 2B).
- Lavar los embriones con 3 mL de tampón de perfusión fría (PB) dos veces y resuspender en 2 mL de PB (Figura 2B).
- Usando el aparato de aislamiento cardíaco embrionario (Figura 2C), extraiga ~ 1 ml de los embriones en la aguja de la jeringa e inmediatamente expulse de nuevo al tubo. Repita este proceso 30 veces, a una velocidad de 1 s por movimiento de jeringa (Figura 2C).
- Pase los embriones fragmentados a través de un tamiz de filtro de células de 100 μm colocado en un embudo y recoja los corazones filtrados en otro tubo de centrífuga de 5 ml. Enjuague la jeringa con 1 ml de PB y recoja este enjuague también en el tubo a través del tamiz (Figura 2C).
- Mezclar bien y separar en tubos de centrífuga de 1,5 ml, con cada tubo conteniendo 1 ml del contenido. Centrifugar todos los tubos en una mini centrífuga de sobremesa durante 5 s (2.000 x g a temperatura ambiente) y desechar los sobrenadantes.
- Realizar la resuspensión en serie de los pellets en los tubos usando 1 mL de PB, es decir, resuspender el pellet en un tubo usando 1 mL de PB y usar ese PB resuspendido para resuspender el pellet en el siguiente tubo.
- Pipetea suavemente los corazones hacia arriba y hacia abajo dos veces antes de agregar una gota de ellos para los estudios correspondientes.
5. Estudios de patch-clamp en células cardiovasculares aisladas
NOTA: Se pueden obtener registros de abrazadera de parche de adentro hacia afuera y de células enteras de las células aisladas como se informó anteriormente para las corrientes del canal KATP en la cardiovasculatura9 del pez cebra.
- Para cardiomiocitos adultos y juveniles, agregue las células disociadas (del paso 2) directamente a la cámara de registro desde la suspensión. Para las celdas VSM, coloque el cubreobjetos que contiene las celdas VSM chapadas (del paso 3) en la cámara de grabación.
- Agregue corazones embrionarios intactos aislados (desde el paso 4) a la cámara desde la suspensión, y haga registros de parche y pinza de los miocitos epicárdicos (Figura 2D).
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Representative Results
Los protocolos anteriores proporcionan de manera confiable y rutinaria suficientes miocitos cardíacos y vasculares de calidad consistente susceptibles de estudios de parche y pinza, como se informó recientemente en estudios extensos de canales de potasio sensible al ATP (K ATP) en cardiovasculatura de pez cebra mutante y de tipo salvaje9. En la Figura 3A-C se muestran trazas representativas de registros de dicha actividad del canal KATP de cardiomiocitos aislados. En el caso de las células aisladas de la arteria bulbosa, las células del músculo liso vascular fueron confirmadas por la expresión de Tg(tagln:egfp) 11,12 (Figura 1). Se obtuvieron grabaciones exitosas de un solo canal (n = 8 grabaciones de N = 5 preparaciones) en parches extirpados de los corazones embrionarios (Figura 3D). Los potenciales de acción se registraron a partir de miocitos ventriculares y auriculares adultos aislados en modo de pinza de corriente de células enteras, utilizando un amplificador de pinza de parche junto con un digitalizador compatible (ver Tabla de materiales). La solución de registro extracelular para las mediciones del potencial de acción (AP) contenía NaCl (140 mM), KCl (4 mM), CaCl 2 (1,8 mM), MgCl2 (1 mM), glucosa (10 mM), HEPES (10 mM) y blebbistatina (0,01 mM, pH 7,4); la solución de registro intracelular contenía KCl (120 mM), EGTA (5 mM), K2 ATP (5 mM), MgCl 2 (5 mM) y HEPES (10 mM, pH7,2). Las pipetas de parche se extrajeron del vidrio de cal sodada y tuvieron resistencias de 3 a 5 MΩ cuando se llenaron con solución intracelular. Los miocitos ventriculares exhiben potenciales de membrana hiperpolarizados estables, y los potenciales de acción fueron estimulados mediante inyección de corriente a través de la pipeta del parche (Figura 3E), mientras que los miocitos auriculares exhibieron un potencial de acción espontánea (Figura 3F). Las propiedades potenciales de acción se resumen en la Tabla 3.
Figura 1: Aislamiento de células arteriosas auriculares, ventriculares y bulbosas. Esquema para ilustrar el aislamiento de las células auriculares (A), ventriculares (B) y arteriosas bulbosas (C). Las imágenes que representan cada tipo de célula aislada (abajo) tienen barras de escala = 50 μm en cada caso. Las células BA aisladas de líneas de pez cebra reportero transgénico de células musculares lisas (Tg(tagln:egfp)11,12) son positivas para fluorescencia verde. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Esquema para ilustrar el aislamiento de corazones embrionarios. (A) Los embriones fertilizados se retiran del tanque de reproducción y se colocan en una placa de Petri que contiene agua E3 y se mantienen a 28 ° C durante un máximo de 5 días. (B) A la edad deseada, los embriones se anestesian in situ utilizando tricaína y se transfieren a PB en tubos de centrífuga de 5 ml para disociación. (C) El aparato de aislamiento cardíaco embrionario consiste en una jeringa de 10 ml unida a una aguja de 19 G montada sobre el tubo de disociación en un soporte de banco, lo que permite que las manos realicen la trituración. (D) Imagen del corazón aislado (día 4) conectado a una pipeta de parche-pinza. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Registros representativos de patch-clamp de tejidos cardiovasculares aislados de pez cebra. (A, B) Canales de ATP K sensibles alATP de adentro hacia afuera registros de pinza de parche extirpados de cardiomiocitos auriculares (A) y ventriculares (B) aislados de peces cebra adultos. (C) La conductancia del canalK ATP se registró a partir del pinzamiento de parches de células VSM enteras aisladas de peces cebra adultos. (D) Actividad del canal K+ único en parches de membrana extirpados de corazones embrionarios de pez cebra (4 dpf). Todos los registros de parches extirpados se realizaron con 140 mM KCl en ambos lados de la membrana, a un potencial de membrana de -50 mV. Las corrientes de toda la célula se registraron con el potencial de membrana sujetado a -70 mV. (E) Ejemplo de registro de pinza de corriente de miocitos ventriculares aislados. Los potenciales de acción fueron estimulados por inyección de corriente como se muestra a continuación. (F) Ejemplo de registro de pinza de corriente de miocito auricular aislado que muestra un disparo potencial de acción espontánea. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| TAMPÓN DE PERFUSIÓN (PB) | 10 mM HEPES, 30 mM Taurina, 5.5 mM Glucosa, 10 mM BDM. Hacer la solución en solución salina tamponada con fosfato (PBS), ajustar el pH a 7.4 | ||
| TAMPÓN DE DIGESTIÓN (DB) | PB + 12,5 μM CaCl2 + 5 mg/mL Col II + 5 mg/mL Col IV + 5 ng/mL Insulina | ||
| BÚFER DE DETENCIÓN (SB) | PB + 10% FBS + 12.5 μM CaCl2 + 10 mg/ml BSA + 5 ng/mL Insulina | ||
Tabla 1: Soluciones para el aislamiento de cardiomiocitos de pez cebra.
| BÚFER S1 | 0,1% BSA (p/v), 145 mM NaCl, 4 mM KCl, 10 mM HEPES, 10 mM glucosa, 0,05 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, ajustado a pH7,4 usando NaOH | ||
| BÚFER S2 | 2 ml S1, 4 mg de papaína, 2 mg de DTT | ||
| BÚFER S3 | 2 mL S1, 3 mg de colagenasa tipo H, 2 mg de inhibidor de tripsina, 1 mg de elastasa | ||
Tabla 2: Soluciones para el aislamiento de células VSM de pez cebra.
| Miocitos ventriculares (n = 3 registros) | |||
| Vm (mV) | APA (mV) | APD50 (ms) | |
| -75,7 ± 3,9 | -119,6 ± 3,8 | 329 ± 163 | |
| Miocitos auriculares (n = 3 registros) | |||
| Tasa AP (min-1) | MDP (mV) | APA (mV) | APD50 (ms) |
| 107,3 ± 32,6 | -71,2 ± 5,1 | 98,4 ± 4,7 | 141 ± 12 |
Tabla 3: Propiedades potenciales de acción de cardiomiocitos aislados de pez cebra. Grabado en modo de abrazadera actual. Los datos se muestran como media ± S.D. Vm = potencial de membrana; APA = amplitud del potencial de acción; APD50 = duración del potencial de acción al 50% de repolarización; MDP = potencial diastólico máximo.
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Discussion
Los métodos previos para aislar miocitos ventriculares del pez cebra5,6, destinados a generar miocitos para cultivo o estudios electrofisiológicos, proporcionaron células de menor rendimiento e involucraron largos pasos de centrifugaciones múltiples que afectaron negativamente la calidad y viabilidad celular. Los protocolos descritos aquí son confiables, cubren cada uno de los tejidos cardiovasculares significativos (ventrículo, aurículas y VSM) y, lo que es más importante, son bastante prácticos para el aislamiento agudo de células vivas. Los enfoques de aislamiento que implican la canulación del ventrículo a través del BA13 pueden ser una alternativa sofisticada para los cardiomiocitos ventriculares, pero requieren un mayor grado de destreza y pueden afectar negativamente el aislamiento auricular. El enfoque detallado en el protocolo actual proporciona una alternativa simple y eficiente.
Las consideraciones adicionales para el aislamiento del tejido cardíaco larvario son: (1) En el paso 1.4, dependiendo de la edad del pez y la ampliación disponible, los tejidos pueden ser visibles incluso antes de extraer los músculos pectorales, en cuyo caso los tejidos pueden ser directamente "arrancados" de los peces sin cirugía previa, y luego los tejidos no CV pueden ser removidos usando pinzas superfinas; (2) En el paso 2.2, para larvas menores de 14 días, los corazones se pueden utilizar directamente para estudios electrofisiológicos sin necesidad de disociación enzimática.
Como se señaló anteriormente, y típicamente cierto para los métodos de disociación enzimática en general, ha demostrado ser importante usar tampones y enzimas nuevos cada vez. Sin embargo, el tampón de perfusión (PB) y el tampón S1 pueden prepararse de antemano y almacenarse a 4-8 °C durante 1 mes.
El tiempo de aislamiento de tejidos exitoso no debe exceder ~ 90 s por pez, y los tejidos no deben exponerse al aire. Cuando la disociación toma más tiempo, la calidad celular (es decir, la supervivencia) se reduce. Al triturar tejidos, se debe tener cuidado para evitar generar burbujas de aire, lo que también reduce la calidad celular. El aislamiento de células VSM es sensible a la digestión por colagenasa en tampón S3. Después de los primeros 3 minutos de digestión, el tubo debe sacarse del termoagitador cada minuto y examinarse en busca de tejidos dilatados y translúcidos flotantes. Una vez que la fragmentación del tejido es evidente, se debe cesar el paso de digestión.
Es importante señalar que estos protocolos no están ampliamente optimizados para aislar cardiomiocitos tolerantes al calcio, como se requeriría para los estudios de contractilidad. Sin embargo, como se muestra, se puede lograr un registro confiable de los potenciales de acción de los cardiomiocitos en presencia de concentraciones fisiológicas de calcio extracelular 7,14. La blebbistatina, incluida para desacoplar la excitación y la contracción, y mejorar la formación de focas giga-Ohm y la eficiencia de registro en estos experimentos, ha demostrado previamente que no afecta significativamente los parámetros AP en corazones intactos de pez cebra14. Para la electrofisiología, el rendimiento absoluto de las células tampoco es rutinariamente limitante de la velocidad. Este protocolo no ha sido optimizado para el rendimiento, como podría ser necesario para estudios bioquímicos de células aisladas. Aún así, el rendimiento logrado con estos métodos es muy adecuado para estudios electrofisiológicos y probablemente para muchos otros enfoques.
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Disclosures
Los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de NIH HL140024 a CGN y HL150277 a CMC. La Figura 1 y la Figura 2 se crearon con BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Centrifuge Tubes | Eppendorf | 22364111 | |
| 10 mL Syringe | Fisher Scientific | 14-955-459 | |
| 19 Guage Needle | BD | 305187 | |
| 2,3-Butanedione Monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 5 mL Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | EP0030119479 | For embryonic heart isolation |
| Axopatch 200B amplifier and Digidata 1200 digitizer | Molecular Devices | Used for action potential recordings | |
| Benchtop Mini Centrifuge | Southern Labware | MLX-106 | |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | 203390 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell-Strainer Sieve | Cole-Parmer | EW-06336-71 | 100 μm sieve for embryonic heart isolation |
| Collagenase Type H | Sigma-Aldrich | C8051 | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS004176 | |
| Collagenase Type IV | Worthington | LS004188 | |
| Curved Forceps | Fisher Scientific | 16-100-110 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | 324626 | |
| Elastase | Worthington | LS003118 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Fine Forceps | Dumont | Style #5 | Ceramic-coated forceps for adult and juvenile CV tissue isolation (Need two) |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I2643 | |
| K2ATP | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| Large Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5981 | For dissociation |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Micro-Hematocrit Capillary Tubes | Kimble Chase | 41A2502 | Soda lime glass for patch pipettes |
| Papain | Worthington | LS003118 | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-6A | |
| Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5606 | 100 mm x 20 mm, for embryonic heart isolation |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 806552 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | For adult and juvenile zebrafish decapitation |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Super Fine Forceps | Dumont | Style #SF | For isolating larval CV tissues (Need two) |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Thermoshaker | ThermoFisher Scientific | 13687711 | |
| Tricaine Methanesulfonate (MS222) | For anaesthetizing zebrafish larvae | ||
| Trypsin Inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 |
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