Summary
Den nuværende protokol beskriver den akutte isolering af levedygtige hjerte- og vaskulære glatte muskelceller fra voksne, unge, larver og embryonale zebrafisk (Danio rerio), der er egnede til elektrofysiologiske undersøgelser.
Abstract
Zebrafisk har længe været brugt som en model hvirveldyr organisme i hjerte-kar-forskning. De tekniske vanskeligheder ved at isolere individuelle celler fra zebrafiskens kardiovaskulære væv har været begrænsende i studiet af deres elektrofysiologiske egenskaber. Tidligere metoder er beskrevet til dissektion af zebrafiskhjerter og isolering af ventrikulære hjertemyocytter. Imidlertid var isoleringen af zebrafisk atriale og vaskulære myocytter til elektrofysiologisk karakterisering ikke detaljeret. Dette arbejde beskriver nye og modificerede enzymatiske protokoller, der rutinemæssigt giver isolerede unge og voksne zebrafisk ventrikulære og atriale kardiomyocytter samt vaskulære glatte muskelceller (VSM) fra bulbous arteriosus, egnet til patch-clamp eksperimenter. Der har ikke været noget litterært bevis for elektrofysiologiske undersøgelser af zebrafisk kardiovaskulært væv isoleret på embryonale og larvestadier af udvikling. Delvise dissociationsteknikker, der tillader patch-clamp eksperimenter på individuelle celler fra larve- og embryonale hjerter, demonstreres.
Introduction
Zebrafisk er små teleostfisk, der længe har været brugt som en model hvirveldyrorganisme1 og for nylig er blevet fremtrædende som et levedygtigt hvirveldyrsystem til screening af gener og lægemidler med høj kapacitet 2,3. Fysiologisk analyse af zebrafiskvæv er imidlertid ikke veludviklet. I det kardiovaskulære system er der beskrevet metoder til dissektion af zebrafiskhjerter4 og isolering af ventrikulære hjertemyocytter 5,6,7. Der er få detaljerede beskrivelser af den effektive isolering af atriemyocytter og ingen rapporter om vaskulære glatte muskelpræparater (VSM) til patch-clamp-undersøgelser.
Det nuværende arbejde beskriver metode til isolering af zebrafisk hjerte- og vaskulære myocytter, der er levedygtige til elektrofysiologiske og funktionelle undersøgelser. Denne fremgangsmåde omfatter ændringer af tidligere rapporterede protokoller for zebrafiskventrikulær myocytisolering5,6 og tilpasser metoder fra pattedyrs VSM-celleisolationer8, hvilket muliggør isolering af zebrafiskkarformede glatte muskelceller fra bulbous arteriosus (BA). Protokollerne resulterer i effektive udbytter af isolerede atrie-, ventrikulære og VSM-celler fra zebrafisk, der pålideligt kan bruges i patch-clamp-undersøgelser i op til 8 timer9.
På trods af deres næsten gennemsigtige larver, der udvikler sig helt uden for forældreorganismen, har udforskning af deres lovede ontogenetiske potentiale i studiet af kardiovaskulær udvikling været begrænset af udfordringer med at udvinde og analysere væv i en ung alder. Den nuværende artikel adresserer denne begrænsning ved at demonstrere patch-clamp eksperimenter på zebrafisk hjerter isoleret så tidligt som 3 dage efter befrugtning (dpf) ved hjælp af en tilpasset, offentliggjort ekstraktionsmetode10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle zebrafisk (vildtypestamme AB, både mandlige og kvindelige) blev opdrættet, vedligeholdt og håndteret til forsøgene efter retningslinjerne fra Washington University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Isolering af atrium, ventrikel og bulbøs arteriosus fra voksen, ung og larve zebrafisk
- Afliv fisk ved hjælp af kuldechok, dvs. ved at nedsænke i 4 ° C vand i ~ 10 s.
- Ved hjælp af buede tang overføres fisk til en stor petriskål delvist fyldt med perfusionsbuffer (PB) (tabel 1) og placeres under et dissekerende mikroskop.
- Halshug fisken lige bagud til øjnene ved hjælp af en saks.
- Brug buede tang (fine tang til larvefisk) til at holde fisken i den ikke-dominerende hånd med den ventrale side vendt mod dissektionsomfanget. Med det andet par fine tang (eller superfine til larvefisk) i den dominerende hånd, skal du forsigtigt rive brystmusklerne og finnerne op for at afsløre det kardiovaskulære (CV) væv (atrium, ventrikel og pæreformet arteriosus, BA) (figur 1).
- Placer de fine tang i den dominerende hånd, træk forsigtigt BA ved den skærende spids af BA og den ventrale aorta.
BEMÆRK: BA og hjertet kommer ud af kropshulen.- Adskil forsigtigt BA fra aorta ved at klemme tangen og lokalisere atriumets spids, hvori flere venøse grene konvergerer (sinus venosus). Brug den fine tang til at 'plukke' spidsen af atriummet af sinus venosus. Dette isolerer CV-vævet fra resten af kroppen (figur 1).
2. Dissociation af kardiomyocytter fra voksen, juvenil og larve zebrafisk til elektrofysiologiske undersøgelser
- Brug den fine tang til at 'plukke' atrium og ventrikel ud af CV-vævet isoleret i det tidligere trin.
BEMÆRK: Processen giver mulighed for ren dissektion af hvert væv med minimal krydskontaminering og føles beslægtet med at plukke frugt fra et træ.- Lav en blid tåre i ventriklen ved hjælp af fine tang for at dræne overskydende blod, hvilket kan sikres, når hjertevævet bliver bleg laksefarve fra lyse rødt.
- Det isolerede atrium og ventrikel samles i separate 1,5 ml centrifugerør indeholdende perfusionsbuffer (PB; 1,5 ml).
BEMÆRK: For at garantere en vellykket dissociation af voksne zebrafisk atriale kardiomyocytter (ACM'er) og ventrikulære kardiomyocytter (VCM'er) er der typisk brug for fire atria og tre ventrikler. I tilfælde af unge zebrafisk (28-90 dage) fordobles dette antal.- I tilfælde af larve zebrafisk (14-28 dage), indsamle så meget væv som muligt fra ~ 30 larver.
- Sæt PB i rørene ud med 750 μL fordøjelsesbuffer (DB) (tabel 1) hver, og rør anbringes på en termoshaker ved 37 °C og 800 o/min. Tillad fordøjelse af vævene, indtil de bliver gennemskinnelige (~ 30 min for atrierne og ~ 40 min for ventriklerne).
- Afslut fordøjelsen ved forsigtigt at dreje vævene ned i en minicentrifuge (2.000 x g ved omgivelsestemperatur) i 3-5 sekunder, og udskift supernatanten DB med 750 μL stopbuffer (SB) hver (tabel 1).
BEMÆRK: Dette centrifugeringstrin er valgfrit for VCM-isolering. - Inkuber det pelleterede væv i SB ved omgivelsestemperatur i 15 min.
- Udskift forsigtigt SB med 500-750 μL PB hver (afhængigt af den ønskede tæthed af de endelige celler) og triturere vævene (~ 30 gange) ved hjælp af en flammepoleret Pasteur-pipette for at sprede cellerne.
BEMÆRK: Kardiomyocytterne (CM'er) er nu klar til elektrofysiologiske undersøgelser og opbevares ved stuetemperatur i op til 8 timer. - For ensartet prøveudtagning pipetteres cellerne forsigtigt op og ned et par gange for at resuspendere, før der tilsættes en dråbe af dem til tilsvarende undersøgelser.
3. Dissociation af vaskulære glatte muskelceller (VSM) fra voksne og unge zebrafisk til elektrofysiologiske undersøgelser
- Pluk bulbøs arteriosus (BA) fra CV-vævene ved hjælp af samme fremgangsmåde som trin 2.1 og saml fem voksne BA'er i et 1,5 ml centrifugerør indeholdende S1-buffer (1,5 ml) (tabel 2). For unge zebrafisk, pulje ti BA'er og, for larver ældre end 2 uger, pool 30-40 BA'er.
BEMÆRK: Det er ikke praktisk muligt at isolere VSM-celler fra zebrafisklarver yngre end 2 uger. - Udskift S1 med 400 μL S2-buffer (tabel 2), og lad papain (se materialetabel) fordøjelse af BA'erne på en termoshaker ved 37 °C og 800 o / min i ~ 20 min.
- Lad de delvist fordøjede BA'er sætte sig ned i 1 minut, og udskift supernatanten S2 med 500 μL S3-buffer (tabel 2) indeholdende collagenase. Vævene fordøjes på en termoshaker ved 37 °C og 800 o/min i 3-5 min.
- Afslut fordøjelsen ved forsigtigt at dreje vævene ned i en minicentrifuge (2.000 x g ved omgivelsestemperatur) i 3-5 s og erstatte supernatant S3 med 500 μL S1.
- Triturér forsigtigt det pelleterede væv (~ 15 gange) for at sprede VSM-celler og plade på glasdæksler af passende størrelse.
BEMÆRK: Dækslipstørrelsen bestemmes af størrelsen på patch-clamp-optagekammeret, i dette tilfælde blev der brugt 5 x 5 mm).- Opbevar dækslikkerne ved stuetemperatur i 30 minutter, så cellerne kan fastgøres og bruge dem inden for de næste 6 timer.
4. Isolering af hjerter fra embryonal zebrafisk til elektrofysiologiske undersøgelser
- Der tilsættes tricain (150 mg/l; 1 ml pr. 100 mm x 20 mm petriskål) til ~300 embryoner (2-5 dpf), opsamlet fra deres inkubationsbetingelser (figur 2A).
- De bedøvede embryoner koncentreres ved at overføre dem til et 5 ml centrifugerør ved hjælp af en transferpipette og fjerne overskydende medier (E3) fra centrifugerøret (figur 2B).
- Embryonerne vaskes med 3 ml kold perfusionsbuffer (PB) to gange, og der resuspenderes i 2 ml PB (figur 2B).
- Brug det embryonale hjerteisoleringsapparat (figur 2C) til at trække ~ 1 ml embryoner ind i sprøjtenålen og straks udvise dem tilbage i røret. Gentag denne proces 30 gange med en hastighed på 1 s pr. sprøjtebevægelse (figur 2C).
- Før de fragmenterede embryoner gennem en 100 μm cellesisigte placeret i en tragt og saml de filtrerede hjerter i et andet 5 ml centrifugerør. Skyl sprøjten med 1 ml PB, og skyl skyllet godt ind i røret gennem sigten (figur 2C).
- Bland godt og adskil i 1,5 ml centrifugerør, hvor hvert rør indeholder 1 ml af indholdet. Centrifuge alle rørene på en minicentrifuge i 5 s (2.000 x g ved omgivelsestemperatur) og kassér supernatanterne.
- Udfør seriel resuspension af pellets i rørene ved hjælp af 1 ml PB, dvs. suspender pelleten i et rør ved hjælp af 1 ml PB og brug den resuspenderede PB til at resuspendere pelleten i det næste rør.
- Pipetter forsigtigt hjerterne op og ned to gange, før du tilføjer en dråbe af dem til tilsvarende undersøgelser.
5. Patch-clamp undersøgelser af isolerede kardiovaskulære celler
BEMÆRK: Inside-out og helcelle patch-clamp optagelser fra de isolerede celler kan opnås som tidligere rapporteret for KATP kanalstrømme i zebrafisk kardiovaskulatur9.
- For voksne og juvenil kardiomyocytter tilsættes de dissocierede celler (fra trin 2) direkte til optagekammeret fra suspension. For VSM-celler skal du placere dækslippet indeholdende de belagte VSM-celler (fra trin 3) i optagekammeret.
- Tilsæt isolerede intakte embryonale hjerter (fra trin 4) til kammeret fra suspension, og lav patch-klemmeoptagelser fra de epikardiale myocytter (figur 2D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ovennævnte protokoller giver pålideligt og rutinemæssigt tilstrækkelige hjerte- og vaskulære myocytter af ensartet kvalitet, der kan bruges til patch-clamp-undersøgelser som for nylig rapporteret i omfattende undersøgelser af ATP-følsomme kaliumkanaler (KATP) i vildtype og mutant zebrafisk kardiovaskulatur9. Repræsentative spor af optagelser af sådan KATP-kanalaktivitet fra isolerede kardiomyocytter er vist i figur 3A-C. I tilfælde af celler isoleret fra bulbøs arteriosus blev de vaskulære glatte muskelceller bekræftet af Tg (tagln: egfp) ekspression11,12 (figur 1). Der blev opnået vellykkede enkeltkanalsoptagelser (n = 8 optagelser fra N = 5 præparater) i plastre, der blev udskåret fra de embryonale hjerter (figur 3D). Handlingspotentialer blev registreret fra isolerede voksne zebrafisk ventrikulære og atriemyocytter i helcelle, strømklemmetilstand ved hjælp af en patch-clamp forstærker sammen med en kompatibel digitizer (se Materialetabel). Den ekstracellulære optagelsesløsning til aktionspotentialemålingerne (AP) indeholdt NaCl (140 mM), KCl (4 mM), CaCl 2 (1,8 mM), MgCl2 (1 mM), glucose (10 mM), HEPES (10 mM) og Blebbistatin (0,01 mM, pH 7,4); den intracellulære registreringsopløsning indeholdt KCl (120 mM), EGTA (5 mM), K2 ATP (5 mM), MgCl 2 (5 mM) og HEPES (10 mM, pH7,2). Patchpipetter blev trukket ud af sodakalkglas og havde modstande på 3 - 5 MΩ, når de blev fyldt med intracellulær opløsning. Ventrikulære myocytter udviser stabile hyperpolariserede membranpotentialer, og handlingspotentialer blev stimuleret via strøminjektion gennem plasterpipetten (figur 3E), mens atriemyocytter udviste spontan effektpotentialefyring (figur 3F). Handlingspotentialer er opsummeret i tabel 3.
Figur 1: Isolering af atrie-, ventrikulære og pæreformede arteriosusceller. Skematisk for at illustrere isoleringen af atriale (A), ventrikulære (B) og pæreformede arteriosus (C) celler. Billederne, der viser hver isoleret celletype (nederst), har skalabjælker = 50 μm i hvert tilfælde. BA-celler isoleret fra glat muskelcelletransgene reporter zebrafisklinjer (Tg (tagln: egfp) 11,12) er positive for grøn fluorescens. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Skematisk for at illustrere isoleringen af embryonale hjerter. (A) Befrugtede embryoner fjernes fra avlstanken og anbringes i en petriskål indeholdende E3-vand og opbevares ved 28 °C i op til 5 dage. (B) Ved ønsket alder bedøves embryoner in situ ved hjælp af tricain og overføres til PB i 5 ml centrifugerør til dissociation. (C) Embryonalt hjerteisoleringsapparat består af en 10 ml sprøjte fastgjort til en 19 G nål monteret over dissociationsrøret på et bænkstativ, så hænderne kan udføre triturationen. (D) Billede af det isolerede hjerte (dag 4) fastgjort til en lappeklemmepipette. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Repræsentative patch-clamp-optagelser fra isolerede zebrafisk-kardiovaskulære væv. (A, B) ATP-følsomme KATP-kanaler fra inside-out udskårne patch-clamp-optagelser af atriale (A) og ventrikulære (B) kardiomyocytter isoleret fra voksne zebrafisk. (C) K ATP-kanalkonduktans blev registreret fra helcelleplaster-fastspænding af VSM-celler isoleret fra voksne zebrafisk. (D) Single K+ kanalaktivitet i membranpletter udskåret fra zebrafiskens embryonale hjerter (4 dpf). Alle udskårne patchoptagelser blev foretaget med 140 mM KCl på begge sider af membranen ved -50 mV membranpotentiale. Helcellestrømme blev registreret med membranpotentialet fastspændt ved -70 mV. (E) Eksempel på strømklemmeoptagelse fra isoleret ventrikulær myocyt. Handlingspotentialer blev stimuleret af den nuværende injektion som vist nedenfor. (F) Eksempel på strømklemmeoptagelse fra isoleret atriemyocyt, der viser spontan handling potentiel affyring. Klik her for at se en større version af denne figur.
| PERFUSIONSBUFFER (PB) | 10 mM HEPES, 30 mM taurin, 5,5 mM glukose, 10 mM BDM. Opløsningen fremstilles i fosfatbufferet saltvand (PBS), justeres pH til 7,4 | ||
| FORDØJELSESBUFFER (DB) | PB + 12,5 μM CaCl2 + 5 mg/ml Col II + 5 mg/ml Col IV + 5 ng/ml insulin | ||
| STOP BUFFER (SB) | PB + 10% FBS + 12,5 μM CaCl2 + 10 mg/ml BSA + 5 ng/ml insulin | ||
Tabel 1: Løsninger til isolering af zebrafisk kardiomyocytter.
| S1 BUFFER | 0,1 % BSA (w/v), 145 mM NaCl, 4 mM KCl, 10 mM HEPES, 10 mM glucose, 0,05 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, justeret til pH7,4 ved hjælp af NaOH | ||
| S2 BUFFER | 2 ml S1, 4 mg Papain, 2 mg DTT | ||
| S3 BUFFER | 2 ml S1, 3 mg kollagenase type H, 2 mg trypsinhæmmer, 1 mg elastase | ||
Tabel 2: Opløsninger til isolering af zebrafisk VSM-celler.
| Ventrikulære myocytter (n = 3 optagelser) | |||
| Vm (mV) | APA (mV) | APD50 (ms) | |
| -75,7 ± 3,9 | -119,6 ± 3,8 | 329 ± 163 | |
| Atriale Myocytter (n = 3 Optagelser) | |||
| AP-sats (min-1) | MDP (mV) | APA (mV) | APD50 (ms) |
| 107,3 ± 32,6 | -71,2 ± 5,1 | 98,4 ± 4,7 | 141 ± 12 |
Tabel 3: Aktionspotentiale egenskaber fra isolerede zebrafisk kardiomyocytter. Optaget i aktuel klemmetilstand. Data vist som gennemsnit ± S.D. Vm = membranpotentiale; APA = handlingspotentiale amplitude; APD50 = varighed af handlingspotentiale til 50% repolarisering; MDP = maksimalt diastolisk potentiale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tidligere metoder til isolering af zebrafiskventrikulære myocytter5,6, der havde til formål at generere myocytter til dyrkning eller elektrofysiologiske undersøgelser, gav celler med lavere udbytte og involverede lange trin med flere centrifugeringer, der påvirkede cellekvaliteten og levedygtigheden negativt. De protokoller, der er beskrevet her, er pålidelige, dækker hvert af de betydelige kardiovaskulære væv (ventrikel, atria og VSM), og vigtigere er ret praktiske til akut isolering af levende celler. Isolationsmetoder, der involverer kannulering af ventriklen via BA13, kan være et sofistikeret alternativ til ventrikulære kardiomyocytter, men kræver en højere grad af fingerfærdighed og kan påvirke atrieisolering negativt. Den fremgangsmåde, der er beskrevet i den nuværende protokol, er et enkelt og effektivt alternativ.
Yderligere overvejelser for larvehjertevævsisolering er: (1) I trin 1.4, afhængigt af fiskens alder og forstørrelse til rådighed, kan vævene være synlige, selv før brystmusklerne fjernes, i hvilket tilfælde vævene kan "plukkes" direkte ud af fisken uden forudgående operation, og derefter kan ikke-CV-vævene fjernes ved hjælp af superfine tang; (2) I trin 2.2 kan hjerterne for larver yngre end 14 dage bruges direkte til elektrofysiologiske undersøgelser uden behov for enzymatisk dissociation.
Som nævnt ovenfor, og typisk gælder for enzymatiske dissociationsmetoder generelt, har det vist sig vigtigt at bruge friske buffere og enzymer hver gang. Perfusionsbuffer (PB) og S1-buffer kan dog tilberedes på forhånd og opbevares ved 4-8 °C i 1 måned.
En vellykket vævsisoleringstid bør ikke overstige ~ 90 s pr. Fisk, og væv bør ikke udsættes for luft. Når dissociation tager længere tid, reduceres cellekvaliteten (dvs. overlevelse). Ved triturering af væv skal man sørge for at undgå at generere luftbobler, hvilket også reducerer cellekvaliteten. VSM-celleisolering er følsom over for fordøjelsen ved kollagenase i S3-buffer. Efter de første 3 minutters fordøjelse skal røret tages ud af termoshakeren hvert minut og undersøges for flydende dilateret og gennemskinneligt væv. Når vævsfragmentering er tydelig, skal fordøjelsestrinnet ophøre.
Det er vigtigt at bemærke, at disse protokoller ikke er i vid udstrækning optimeret til isolering af calciumtolerante kardiomyocytter, som det ville være nødvendigt for kontraktilitetsundersøgelser. Som vist kan pålidelig registrering af kardiomyocytaktionspotentialer opnås i nærværelse af fysiologiske ekstracellulære calciumkoncentrationer 7,14. Blebbistatin, der er inkluderet til at afkoble excitation og sammentrækning og forbedre giga-Ohm-tætningsdannelse og registreringseffektivitet i disse eksperimenter, har tidligere vist sig ikke at påvirke AP-parametrene i intakte zebrafiskhjerter14. For elektrofysiologi er det absolutte udbytte af celler heller ikke rutinemæssigt hastighedsbegrænsende. Denne protokol er ikke optimeret til udbytte, som det kan være nødvendigt for biokemiske undersøgelser af isolerede celler. Alligevel er udbyttet opnået med disse metoder velegnet til elektrofysiologiske undersøgelser og sandsynligvis flere andre tilgange.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NIH-tilskud HL140024 til CGN og HL150277 til CMC. Figur 1 og figur 2 blev oprettet med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Centrifuge Tubes | Eppendorf | 22364111 | |
| 10 mL Syringe | Fisher Scientific | 14-955-459 | |
| 19 Guage Needle | BD | 305187 | |
| 2,3-Butanedione Monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 5 mL Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | EP0030119479 | For embryonic heart isolation |
| Axopatch 200B amplifier and Digidata 1200 digitizer | Molecular Devices | Used for action potential recordings | |
| Benchtop Mini Centrifuge | Southern Labware | MLX-106 | |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | 203390 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell-Strainer Sieve | Cole-Parmer | EW-06336-71 | 100 μm sieve for embryonic heart isolation |
| Collagenase Type H | Sigma-Aldrich | C8051 | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS004176 | |
| Collagenase Type IV | Worthington | LS004188 | |
| Curved Forceps | Fisher Scientific | 16-100-110 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | 324626 | |
| Elastase | Worthington | LS003118 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Fine Forceps | Dumont | Style #5 | Ceramic-coated forceps for adult and juvenile CV tissue isolation (Need two) |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I2643 | |
| K2ATP | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| Large Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5981 | For dissociation |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Micro-Hematocrit Capillary Tubes | Kimble Chase | 41A2502 | Soda lime glass for patch pipettes |
| Papain | Worthington | LS003118 | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-6A | |
| Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5606 | 100 mm x 20 mm, for embryonic heart isolation |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 806552 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | For adult and juvenile zebrafish decapitation |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Super Fine Forceps | Dumont | Style #SF | For isolating larval CV tissues (Need two) |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Thermoshaker | ThermoFisher Scientific | 13687711 | |
| Tricaine Methanesulfonate (MS222) | For anaesthetizing zebrafish larvae | ||
| Trypsin Inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 |
References
- Vascotto, S. G., Beckham, Y., Kelly, G. M. The zebrafish's swim to fame as an experimental model in biology. Biochemistry and Cell Biology. 75 (5), 479-485 (1997).
- Love, D. R., Pichler, F. B., Dodd, A., Copp, B. R., Greenwood, D. R. Technology for high-throughput screens: The present and future using zebrafish. Current Opinion in Biotechnology. 15 (6), 564-571 (2004).
- Keßler, M., Rottbauer, W., Just, S. Recent progress in the use of zebrafish for novel cardiac drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (11), 1231-1241 (2015).
- Singleman, C., Holtzman, N. G. Heart dissection in larval, juvenile and adult zebrafish, Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (55), e3165 (2011).
- Brette, F., et al. Characterization of isolated ventricular myocytes from adult zebrafish (Danio rerio). Biochemical and Biophysical Research Communications. 374 (1), 143-146 (2008).
- Sander, V., Sune, G., Jopling, C., Morera, C., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and in vitro culture of primary cardiomyocytes from adult zebrafish hearts. Nature protocol. 8, 800-809 (2013).
- Nemtsas, P., Wettwer, E., Christ, T., Weidinger, G., Ravens, U. Adult zebrafish heart as a model for human heart? An electrophysiological study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 48 (1), 161-171 (2010).
- Huang, Y., et al. Cardiovascular consequences of KATP overactivity in Cantu syndrome. JCI insight. 3 (15), 137799 (2018).
- Singareddy, S. S., et al. ATP-sensitive potassium channels in zebrafish cardiac and vascular smooth muscle. The Journal of Physiology. , (2021).
- Burns, C. G., MacRae, C. A. Purification of hearts from zebrafish embryos. BioTechniques. 40 (3), 274-282 (2006).
- Seiler, C., Abrams, J., Pack, M. Characterization of zebrafish intestinal smooth muscle development using a novel sm22α-b promoter. Developmental Dynamics. 239, 2806-2812 (2010).
- Yang, X. Y., et al. Whole amount in situ hybridization and transgene via microinjection in zebrafish. Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 36 (3), 243-247 (2003).
- Kompella, S. N., Brette, F., Hancox, J. C., Shiels, H. A. Phenanthrene impacts zebrafish cardiomyocyte excitability by inhibiting IKr and shortening action potential duration. The Journal of General Physiology. 153 (2), 202012733 (2021).
- Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cellular Physiology and Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).
