Charakterisierung von Blood Outgrowth Endothelial Cells (BOEC) aus porcinem peripherem Blut

Abstract

Das Endothel ist eine dynamische, integrierte Struktur, die eine wichtige Rolle bei vielen physiologischen Funktionen wie Angiogenese, Hämostase, Entzündung und Homöostase spielt. Das Endothel spielt auch eine wichtige Rolle bei Pathophysiologien wie Arteriosklerose, Bluthochdruck und Diabetes. Endothelzellen bilden die innere Auskleidung von Blut- und Lymphgefäßen und weisen eine Heterogenität in Struktur und Funktion auf. Verschiedene Gruppen haben die Funktionalität von Endothelzellen aus menschlichem peripherem Blut evaluiert, wobei der Schwerpunkt auf endothelialen Vorläuferzellen liegt, die aus hämatopoetischen Stammzellen oder reifen Endothelzellen (oder endothelialen koloniebildenden Zellen) stammen. Diese Zellen stellen eine autologe Ressource für Therapeutika und die Modellierung von Krankheiten dar. Xenogene Zellen können aufgrund ihrer Verfügbarkeit und Homogenität, die durch die Verwendung genetisch ähnlicher Tiere, die unter ähnlichen Bedingungen aufgezogen wurden, erreicht werden, eine alternative Quelle für Therapeutika darstellen. Daher wurde ein robustes Protokoll für die Isolierung und Expansion von hochproliferativen Endothelzellen aus porcinem peripherem Blut vorgestellt. Diese Zellen können für zahlreiche Anwendungen verwendet werden, z. B. für das kardiovaskuläre Gewebezüchten, die Zelltherapie, die Modellierung von Krankheiten, das Screening von Medikamenten, die Untersuchung der Biologie von Endothelzellen und In-vitro-Kokulturen zur Untersuchung von Entzündungs- und Gerinnungsreaktionen bei der Xenotransplantation.

Introduction

Das Endothel ist ein hochkomplexes, dynamisches Gebilde und ein wichtiger Bestandteil der Gefäßwand. Es kleidet die innere Oberfläche der Blutgefäße aus, um eine physikalische Schnittstelle zwischen zirkulierendem Blut und dem umgebenden Gewebe zu schaffen. Es ist bekannt, dass diese heterogene Struktur verschiedene Funktionen wie Angiogenese, Entzündung, Vasoregulation und Hämostase ausübt 1,2,3,4. Humane Nabelvenen-Endothelzellen sind ein umfassend untersuchter Zelltyp, um die Funktionalität von Endothelzellen zu beurteilen. Die patientenspezifische Chargenvariabilität, der inkonsistente Phänotyp und die minimale Teilungseffizienz deuten jedoch darauf hin, dass eine Zellquelle bestimmt werden muss, die all diese Merkmale verbessern könnte⁵.

Eine homogene Population von primären Endothelzellen zu erhalten, kann eine technische Herausforderung darstellen, und primäre Endothelzellen besitzen keine hohe proliferative Kapazität⁶. Um die vaskuläre Regeneration zu untersuchen und pathophysiologische Prozesse zu bewerten, haben verschiedene Gruppen versucht, verschiedene Arten von Endothelzellen aus peripherem Blut zu erhalten und zu bewerten, z. B. Endothelvorläuferzellen (EPCs) oder Blutauswuchs-Endothelzellen (BOECs)6,7,8,9 . Die spindelförmigen frühen EPCs stammen aus hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) und haben eine begrenzte Wachstumspotenz und eine begrenzte angiogene Fähigkeit, reife Endothelzellen zu produzieren. Darüber hinaus ähneln sie entzündlichen Monozyten sehr. Darüber hinaus ist ihre Fähigkeit, sich weiter in funktionsfähige, proliferierende, reife Endothelzellen zu differenzieren, noch umstritten 6,7,9,10. Die kontinuierliche Kultivierung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) kann zu einer sekundären Population von Zellen führen, die als Late-Outgrowth-EPCs, BOECs oder endotheliale koloniebildende Zellen (ECFCs) bekannt sind6,7,9,10. Medina et al. erkannten 2018 die Grenzen von EPCs, die Mehrdeutigkeit ihrer Nomenklatur sowie einen allgemeinen Mangel an Übereinstimmung mit vielen verschiedenen Zelltypen an, die kontinuierlich unter EPCs¹¹ gruppiert werden. Im Gegensatz dazu sind BOECs für ihre Rolle bei der Gefäßreparatur, Gesundheit und Krankheit sowie der Zelltherapie anerkannt. Weitere Studien und therapeutische Anwendungen dieser Zellen werden sich auf Protokolle stützen, um diese Zelltypen konsistent aus zirkulierenden Vorläuferzellen abzuleiten.

Primärzellen wie BOECs können als Surrogat verwendet werden, um hochproliferative reife Endothelzellen zu erhalten⁶. BOECs unterscheiden sich phänotypisch von frühen EPCs und weisen typische endotheliale Merkmale wie die Morphologie des Kopfsteinpflasters und die Expression von Adhärenzkontakten und Caveolae^{auf 12}. Das Gen-Profiling von Hebbel et al.13,14,15 ergab^, dass BOECs oder ECFCs die wahren Endothelzellen sind, da sie die Bildung von mikrovaskulären und großen Gefäßen fördern. Somit können BOECs als Werkzeug zur Bewertung pathophysiologischer Prozesse und genetischer Variation verwendet werden¹⁶. Sie gelten auch als hervorragende Zellquelle für die Zelltherapie zur Gefäßregeneration¹⁷. Daher ist ein standardisiertes Protokoll zur konsistenten Gewinnung dieser hochproliferativen Zellen unerlässlich.

Während BOECs ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung der pathophysiologischen und genetischen Variation des Menschen darstellen, kann eine homogenere Quelle von BOECs robustere und zuverlässigere experimentelle und therapeutische Ergebnisse liefern. Eine überlegene Homogenität kann durch die Verwendung von xenogenen Zellquellen erreicht werden, die von genetisch ähnlichen Tieren stammen, die unter ähnlichen Bedingungen aufgezogen wurden¹⁸. Während xenogene Zellquellen dazu neigen, eine Immunantwort des Wirts hervorzurufen, werden Immunmodulationsstrategien mit dem Ziel entwickelt, immunkompatible Tiere und tierische Produkte, einschließlich Zellen, zu erzeugen. Insbesondere Schweine sind eine ergiebige Quelle für peripheres Blut und werden aufgrund anatomischer und physiologischer Ähnlichkeiten mit dem Menschen häufig zur Untersuchung von Medizinprodukten und anderen Therapien verwendet. Daher verfeinert diese Studie das Protokoll für die Isolierung und Expansion hochproliferativer BOECs aus porcinem peripherem Blut. Das unten beschriebene Protokoll ist eine einfache und zuverlässige Methode, um eine große Anzahl von BOECs aus einer relativ kleinen Blutmenge zu gewinnen. Die Kulturen können über mehrere Passagen erweitert werden, um aus einer einzigen Blutprobe Millionen von Zellen zu erzeugen.

Protocol

Alle Tierversuche wurden von den jeweiligen Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) am Medical College of Wisconsin und der Mayo Clinic genehmigt. HINWEIS: In dieser Studie wurden Yorkshire/Landrace/Duroc-Kreuzungsschweine (Sus domesticus), männlich und weiblich, 40-80 kg, 3-6 Monate alt, verwendet. 1. Entnahme von peripherem Schweineblut Bereiten Sie Materialien vor.Heparinlösung in steriler Kochsalzlösung…

Representative Results

Die Morphologie der kultivierten Zellen wurde vom Beginn der Kultur bis zur Beobachtung von BOEC-Kolonien beobachtet (Abbildung 1). Eine kleinere Population adhärenter Zellen begann sich an die Kulturschalen anzuheften und zu wachsen, während nicht-adhärente Zellen mit Nährmedienwechsel entfernt wurden (Abbildung 1B). Die Kolonien erschienen erstmals an Tag 6 als eine Ansammlung von endothelialen Zellen, die von einem zentralen Punkt aus radial nach außen p…

Discussion

BOECs sind ein leistungsfähiges Werkzeug, das in verschiedenen wissenschaftlichen und therapeutischen Ansätzen eingesetzt werden kann ^7,8,16. BOECs wurden verwendet, um die EC-Genexpression zu analysieren, um die Schlüsselfaktoren aufzuklären, die für die Entwicklung von Gefäßerkrankungen und Krebs verantwortlich sind 5,19,20,21.…

Materials

19 G needle	Covidien	1188818112
50 mL conical tubes	Corning	352098
6 well plate	BD Falcon	353046
60 mL syringes	Covidien	8881560125
Ammonium chloride solution (0.8%)	Stemcell Technologies	07850
Antibiotic/antimycotic solution (100x)	Gibco	15240-062
Centrifuge	Thermo Scientific	75-253-839
EGM-2 culture medium	Lonza Walkersville	CC-3162
Extension tube	Hanna Pharmaceutical Supply Co.	03382C6227
Fetal bovine serum (FBS)	Atlas Biologicals	F-0500-A
Ficoll-Paque 1077	Cytiva	17144003	Density gradient solution
Heparin sodium injection (1,000 units/mL)	Pfizer	00069-0058-01
Human plasma fibronectin	Gibco	33016-015
Ice	N/A	N/A
Phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	10010-023
Pipette set	Eppendorf	2231300004
Sterile water	Gibco	15230-162
Thin pipette	Celltreat Scientific	229280