Domuz Periferik Kanından Kan Büyümesi Endotel Hücrelerinin (BOEC) Karakterizasyonu
Abstract
Endotel, anjiyogenez, hemostaz, inflamasyon ve homeostaz gibi birçok fizyolojik fonksiyonda önemli rol oynayan dinamik entegre bir yapıdır. Endotel ayrıca ateroskleroz, hipertansiyon ve diyabet gibi patofizyolojilerde de önemli bir rol oynamaktadır. Endotel hücreleri kan ve lenfatik damarların iç astarını oluşturur ve yapı ve fonksiyonda heterojenlik gösterir. Çeşitli gruplar, hematopoetik kök hücrelerden veya olgun kan büyümesi endotel hücrelerinden (veya endotel kolonisi oluşturan hücrelerden) türetilen endotel progenitör hücrelerine odaklanarak insan periferik kanından türetilen endotel hücrelerinin işlevselliğini değerlendirmiştir. Bu hücreler tedavi ve hastalık modellemesi için otolog bir kaynak sağlar. Ksenojenik hücreler, benzer koşullarda yetiştirilen genetik olarak benzer hayvanların kullanılmasıyla elde edilen kullanılabilirlikleri ve homojenlikleri nedeniyle alternatif bir terapötik kaynak sağlayabilir. Bu nedenle, domuz periferik kanından yüksek proliferatif kan büyümesi endotel hücrelerinin izolasyonu ve genişlemesi için sağlam bir protokol sunulmuştur. Bu hücreler, ksenotransplantasyonda inflamatuar ve pıhtılaşma yanıtlarını araştırmak için kardiyovasküler doku mühendisliği, hücre tedavisi, hastalık modelleme, ilaç taraması, endotel hücre biyolojisinin incelenmesi ve in vitro ko-kültürler gibi sayısız uygulama için kullanılabilir.
Introduction
Endotel oldukça karmaşık, dinamik bir yapıdır ve vasküler duvarın hayati bir bileşenidir. Dolaşımdaki kan ve çevresindeki dokular arasında fiziksel bir arayüz sağlamak için kan damarlarının iç yüzeyini hizalar. Bu heterojen yapının anjiyogenez, inflamasyon, vazoregülasyon ve hemostaz gibi çeşitli işlevleri yerine getirdiği bilinmektedir 1,2,3,4. İnsan göbek damarı endotel hücreleri, endotel hücrelerinin işlevselliğini değerlendirmek için yaygın olarak çalışılan bir hücre tipidir. Bununla birlikte, hastaya özgü parti değişkenliği, tutarsız fenotip ve minimum ayrılma verimliliği, tüm bu özellikleri geliştirebilecek bir hücre kaynağının belirlenmesi ihtiyacını ortaya koymaktadır5.
Primer endotel hücrelerinin homojen bir popülasyonunu elde etmek teknik olarak zor olabilir ve primer endotel hücreleri yüksek proliferatif kapasiteye sahip değildir6. Bu nedenle, vasküler rejenerasyonu incelemek ve patofizyolojik süreçleri değerlendirmek için, çeşitli gruplar periferik kandan türetilen farklı endotel hücreleri tiplerini elde etmeye ve değerlendirmeye çalışmışlardır, örneğin endotel progenitör hücreleri (EPC’ler) veya kan büyümesi endotel hücreleri (BOEC’ler)6,7,8,9 . İğ şeklindeki erken EPC’ler hematopoetik kök hücrelerden (HSC’ler) kaynaklanır ve olgun endotel hücreleri üretmek için sınırlı büyüme potansiyeline ve sınırlı anjiyojenik yeteneğe sahiptir. Ayrıca, enflamatuar monositlere çok benzerler. Ek olarak, işlevsel, çoğalan, olgun endotel hücrelerine daha da farklılaşma kapasiteleri hala tartışmalıdır 6,7,9,10. Periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC’ler) sürekli kültürü, geç büyüme EPC’leri, BOEC’ler veya endotel kolonisi oluşturan hücreler (ECFC’ler) olarak bilinen ikincil bir hücre popülasyonuna yol açabilir6,7,9,10. Medina ve ark. 2018’de, EPC’lerin sınırlamalarını, isimlendirmelerinin belirsizliğini ve EPC’ler11 altında sürekli olarak gruplandırılmış birçok farklı hücre tipiyle genel bir uyum eksikliğini kabul etmiştir. Buna karşılık, BOEC’ler vasküler onarım, sağlık ve hastalık ve hücre tedavisindeki rolleri ile tanınmıştır. Bu hücrelerin daha fazla araştırılması ve terapötik kullanımı, bu hücre tiplerini dolaşımdaki progenitör hücrelerden tutarlı bir şekilde türetmek için protokollere dayanacaktır.
BOEC’ler gibi primer hücreler, yüksek proliferatif olgun endotel hücreleri elde etmek için bir vekil olarak kullanılabilir6. BOEC’ler fenotipik olarak erken EPC’lerden farklıdır ve parke taşı morfolojisi ve aderens kavşaklarının ve kaveoların ekspresyonu gibi tipik endotel özellikleri sergiler12. Hebbel ve ark.13,14,15 tarafından yapılan gen profillemesi, BOEC’lerin veya ECFC’lerin mikrovasküler ve büyük damar oluşumunu teşvik ettikleri için gerçek endotel hücreleri olduğunu bulmuştur. Bu nedenle, BOEC’ler patofizyolojik süreçleri ve genetik çeşitliliği değerlendirmek için bir araç olarak kullanılabilir16. Ayrıca vasküler rejenerasyon için hücre tedavisi için mükemmel bir hücre kaynağı olarak kabul edilirler17. Bu nedenle, bu yüksek proliferatif hücreleri tutarlı bir şekilde türetmek için standartlaştırılmış bir protokol gereklidir.
BOEC’ler insan patofizyolojik ve genetik varyasyonunu incelemek için güçlü bir araç sağlarken, daha homojen bir BOEC kaynağı daha sağlam ve güvenilir deneysel ve terapötik sonuçlar sağlayabilir. Üstün homojenlik, benzer koşullarda yetiştirilen genetik olarak benzer hayvanlardan elde edilen ksenojenik hücre kaynakları kullanılarak elde edilebilir18. Ksenojenik hücre kaynakları konakçı immün yanıtını ortaya çıkarmaya eğilimli olsa da, immünomodülasyon stratejileri, hücreler de dahil olmak üzere immünouyumlu hayvanlar ve hayvansal ürünler üretmek amacıyla geliştirilmektedir. Özellikle domuzlar, bol miktarda periferik kan kaynağıdır ve insanlarla anatomik ve fizyolojik benzerlikler nedeniyle tıbbi cihazları ve diğer terapileri incelemek için yaygın olarak kullanılır. Bu nedenle, bu çalışma, domuz periferik kanından yüksek proliferatif BOEC’lerin izolasyonu ve genişlemesi için protokolü rafine etmektedir. Aşağıda ayrıntılı olarak açıklanan protokol, nispeten küçük bir kan hacminden çok sayıda BOEC elde etmek için basit ve güvenilir bir yöntemdir. Kültürler, tek bir kan örneğinden milyonlarca hücre üretmek için birkaç pasajla genişletilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
BOEC’ler çeşitli bilimsel ve terapötik yaklaşımlarda kullanılabilecek güçlü bir araçtır 7,8,16. BOEC’ler, vasküler hastalıkların ve kanserin gelişiminden sorumlu anahtar faktörleri aydınlatmak için EC gen ekspresyonunu analiz etmek için kullanılmıştır 5,19,20,21. BOEC’ler ayrıca…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar NIH / NHLBI R00 HL129068’den fon almayı kabul etmek istiyorlar.
Materials
| 19 G needle | Covidien | 1188818112 | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 352098 | |
| 6 well plate | BD Falcon | 353046 | |
| 60 mL syringes | Covidien | 8881560125 | |
| Ammonium chloride solution (0.8%) | Stemcell Technologies | 07850 | |
| Antibiotic/antimycotic solution (100x) | Gibco | 15240-062 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75-253-839 | |
| EGM-2 culture medium | Lonza Walkersville | CC-3162 | |
| Extension tube | Hanna Pharmaceutical Supply Co. | 03382C6227 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlas Biologicals | F-0500-A | |
| Ficoll-Paque 1077 | Cytiva | 17144003 | Density gradient solution |
| Heparin sodium injection (1,000 units/mL) | Pfizer | 00069-0058-01 | |
| Human plasma fibronectin | Gibco | 33016-015 | |
| Ice | N/A | N/A | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Pipette set | Eppendorf | 2231300004 | |
| Sterile water | Gibco | 15230-162 | |
| Thin pipette | Celltreat Scientific | 229280 |
Referências
- Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds. Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).
- Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: I. Structure, function, and mechanisms. Circulation Research. 100 (2), 158-173 (2007).
- Pober, J. S., Tellides, G. Participation of blood vessel cells in human adaptive immune responses. Trends in Immunology. 33 (1), 49-57 (2012).
- Navarro, S., et al. The endothelial cell protein C receptor: its role in thrombosis. Thrombosis Research. 128 (5), 410-416 (2011).
- Hasstedt, S. J., et al. Cell adhesion molecule 1: a novel risk factor for venous thrombosis. Blood. 114 (14), 3084-3091 (2009).
- Ormiston, M. L., et al. Generation and culture of blood outgrowth endothelial cells from human peripheral blood. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (106), e53384 (2015).
- Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. Journal of Clinical Investigation. 105 (1), 71-77 (2000).
- Martin-Ramirez, J., Hofman, M., Biggelaar, M. V. D., Hebbel, R. P., Voorberg, J. Establishment of outgrowth endothelial cells from peripheral blood. Nature Protocols. 7 (9), 1709-1715 (2012).
- Gulati, R., et al. Diverse origin and function of cells with endothelial phenotype obtained from adult human blood. Circulation Research. 93 (11), 1023-1025 (2003).
- Hebbel, R. P. Blood endothelial cells: utility from ambiguity. The Journal of Clinical Investigation. 127 (5), 1613-1615 (2017).
- Medina, R. J., et al. Endothelial progenitors: A consensus statement on nomenclature. Stem Cells Translational Medicine. 6 (5), 1316-1320 (2018).
- Medina, R. J., et al. Molecular analysis of endothelial progenitor cell (EPC) subtypes reveals two distinct cell populations with different identities. BMC Medical Genomics. 3, 18 (2010).
- Jiang, A., Pan, W., Milbauer, L. C., Shyr, Y., Hebbel, R. P. A practical question based on cross-platform microarray data normalization: are BOEC more like large vessel or microvascular endothelial cells or neither of them. Journal of Bioinformatics and Computational Biology. 5 (4), 875-893 (2007).
- Pan, W., Shen, X., Jiang, A., Hebbel, R. P. Semi-supervised learning via penalized mixture model with application to microarray sample classification. Bioinformatics. 22 (19), 2388-2395 (2006).
- Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (9), 1584-1595 (2008).
- Fernandez, L. A., et al. Blood outgrowth endothelial cells from hereditary haemorrhagic telangiectasia patients reveal abnormalities compatible with vascular lesions. Cardiovascular Research. 68 (2), 235-248 (2005).
- Critser, P. J., Yoder, M. C. Endothelial colony-forming cell role in neoangiogenesis and tissue repair. Current Opinion in Organ Transplantation. 15 (1), 68-72 (2010).
- Zhao, Y., et al. Isolation and culture of primary aortic endothelial cells from miniature pigs. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59673 (2019).
- Chang Milbauer, L., et al. Genetic endothelial systems biology of sickle stroke risk. Blood. 111 (7), 3872-3879 (2008).
- Wei, P., et al. Differential endothelial cell gene expression by African Americans versusCaucasian Americans: a possible contribution to health disparity in vascular disease and cancer. BMC Medicine. 9 (1), 2 (2011).
- Hasstedt, S. J., et al. Cell adhesion molecule 1: a novel risk factor for venous thrombosis. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 114 (14), 3084-3091 (2009).
- Milbauer, L. C., et al. Blood outgrowth endothelial cell migration and trapping in vivo: a window into gene therapy. Translational Research. 153 (4), 179-189 (2009).
- Matsui, H., et al. Ex vivo gene therapy for hemophilia A that enhances safe delivery and sustained in vivo factor VIII expression from lentivirally engineered endothelial progenitors. Stem Cells. 25 (10), 2660-2669 (2007).
- De Meyer, S. F., et al. Phenotypic correction of von Willebrand disease type 3 blood-derived endothelial cells with lentiviral vectors expressing von Willebrand factor. Blood. 107 (12), 4728-4736 (2006).
- Bodempudi, V., et al. Blood outgrowth endothelial cell-based systemic delivery of antiangiogenic gene therapy for solid tumors. Cancer Gene Therapy. 17 (12), 855-863 (2010).
- Dudek, A. Z., et al. Systemic inhibition of tumour angiogenesis by endothelial cell-based gene therapy. British Journal of Cancer. 97 (4), 513-522 (2007).
- Moubarik, C., et al. Transplanted late outgrowth endothelial progenitor cells as cell therapy product for stroke. Stem Cell Reviews and Reports. 7 (1), 208-220 (2011).
- Pislaru Sorin, V., et al. Magnetic forces enable rapid endothelialization of synthetic vascular grafts. Circulation. 114 (1), 314 (2006).
- Satyananda, V., et al. New concepts of immune modulation in xenotransplantation. Transplantation. 96 (11), 937-945 (2013).
- Klymiuk, N., Aigner, B., Brem, G., Wolf, E. Genetic modification of pigs as organ donors for xenotransplantation. Molecular Reproduction and Development. 77 (3), 209-221 (2010).
- Ryczek, N., Hryhorowicz, M., Zeyland, J., Lipiński, D., Słomski, R. CRISPR/Cas technology in pig-to-human xenotransplantation research. International Journal of Molecular Sciences. 22 (6), 3196 (2021).
- Cooper, D. K., Koren, E., Oriol, R. Genetically engineered pigs. Lancet. 342 (8872), 682-683 (1993).
- Cozzi, E., White, D. J. G. The generation of transgenic pigs as potential organ donors for humans. Nature Medicine. 1 (9), 964-966 (1995).
- Phelps, C. J., et al. Production of alpha 1,3-galactosyltransferase-deficient pigs. Science. 299 (5605), 411-414 (2003).
