Caracterização das Células Endoteliais de Crescimento Sanguíneo (CBO) do Sangue Periférico Porcino
Abstract
O endotélio é uma estrutura dinâmica integrada que desempenha um papel importante em muitas funções fisiológicas, como angiogênese, hemostasia, inflamação e homeostase. O endotélio também desempenha um papel importante em fisiopatologias como aterosclerose, hipertensão e diabetes. As células endoteliais formam o revestimento interno dos vasos sanguíneos e linfáticos e exibem heterogeneidade em estrutura e função. Vários grupos têm avaliado a funcionalidade de células endoteliais derivadas do sangue periférico humano com foco em células progenitoras endoteliais derivadas de células-tronco hematopoéticas ou células endoteliais maduras (ou células formadoras de colônias endoteliais). Essas células fornecem um recurso autólogo para a terapêutica e modelagem de doenças. As células xenogênicas podem fornecer uma fonte alternativa de terapêutica devido à sua disponibilidade e homogeneidade alcançadas pelo uso de animais geneticamente semelhantes criados em condições semelhantes. Assim, um protocolo robusto para o isolamento e expansão de células endoteliais de crescimento sanguíneo altamente proliferativo do sangue periférico suíno tem sido apresentado. Essas células podem ser usadas para inúmeras aplicações, tais como engenharia de tecido cardiovascular, terapia celular, modelagem de doenças, triagem de drogas, estudo da biologia celular endotelial e co-culturas in vitro para investigar respostas inflamatórias e de coagulação em xenotransplante.
Introduction
O endotélio é uma estrutura dinâmica e altamente complexa e um componente vital da parede vascular. Ele reveste a superfície interna dos vasos sanguíneos para fornecer uma interface física entre o sangue circulante e os tecidos circundantes. Sabe-se que essa estrutura heterogênea desempenha várias funções, como angiogênese, inflamação, vasorregulação e hemostasia1,2,3,4. As células endoteliais da veia umbilical humana são um tipo celular amplamente estudado para avaliar a funcionalidade das células endoteliais. No entanto, a variabilidade do lote específico do paciente, o fenótipo inconsistente e a eficiência mínima de divisão sugerem a necessidade de determinar uma fonte celular que possa melhorar todas essas características5.
A obtenção de uma população homogênea de células endoteliais primárias pode ser tecnicamente desafiadora, e as células endoteliais primárias não possuem alta capacidadeproliferativa6. Assim, para estudar a regeneração vascular e avaliar processos fisiopatológicos, vários grupos têm tentado obter e avaliar diferentes tipos de células endoteliais derivadas do sangue periférico, por exemplo, células progenitoras endoteliais (CPEs) ou células endoteliais de crescimento sanguíneo (BCAB)6,7,8,9 . As CPEs precoces fusiformes originam-se de células-tronco hematopoéticas (CTHs) e têm potência de crescimento limitada e capacidade angiogênica limitada de produzir células endoteliais maduras. Além disso, assemelham-se muito aos monócitos inflamatórios. Além disso, sua capacidade de se diferenciar em células endoteliais maduras, proliferantes e funcionais ainda é discutível6,7,9,10. A cultura contínua de células mononucleares do sangue periférico (CMSP) pode dar origem a uma população secundária de células conhecidas como CPEs de crescimento tardio, BOECs ou células formadoras de colônias endoteliais (CEFCs)6,7,9,10. Medina et al., em 2018, reconheceram as limitações das CPEs, a ambiguidade de sua nomenclatura, juntamente com uma falta geral de concordância com muitos tipos celulares distintos continuamente agrupados sob CPEs11. Em contraste, os BOECs tornaram-se reconhecidos por seu papel no reparo vascular, saúde e doença e terapia celular. Estudos futuros e uso terapêutico dessas células dependerão de protocolos para derivar consistentemente esses tipos celulares de células progenitoras circulantes.
Células primárias como as BOECs podem ser usadas como substituto para a obtenção de células endoteliais maduras altamente proliferativas6. As EEP são fenotipicamente distintas das CPEs precoces e exibem características endoteliais típicas, como morfologia de paralelepípedos e expressão de junções aderentes ecavéolas12. O perfil gênico de Hebbel et al.13,14,15 constatou que as BOECs ou ECFCs são as verdadeiras células endoteliais, pois promovem a formação de microvasculares e grandes vasos. Assim, as EEP podem ser utilizadas como ferramenta para avaliar processos fisiopatológicos e variação genética16. Também são considerados uma excelente fonte celular para terapia celular para regeneração vascular17. Portanto, um protocolo padronizado para derivar consistentemente essas células altamente proliferativas é essencial.
Enquanto os BOECs fornecem uma ferramenta poderosa para estudar a variação patofisiológica e genética humana, uma fonte mais homogênea de BOECs pode fornecer resultados experimentais e terapêuticos mais robustos e confiáveis. Homogeneidade superior pode ser obtida com o uso de fontes de células xenogênicas derivadas de animais geneticamente semelhantes criados em condições semelhantes18. Enquanto fontes de células xenogênicas são propensas a provocar uma resposta imune do hospedeiro, estratégias de imunomodulação estão sendo desenvolvidas com o objetivo de gerar animais imunocompatíveis e produtos de origem animal, incluindo células. Os porcos, em particular, são uma fonte abundante de sangue periférico e são comumente usados para estudar dispositivos médicos e outras terapias devido às semelhanças anatômicas e fisiológicas com os seres humanos. Assim, este estudo refina o protocolo para o isolamento e expansão de BOECs altamente proliferativas a partir de sangue periférico suíno. O protocolo detalhado abaixo é um método simples e confiável para obter um grande número de BOECs a partir de um volume relativamente pequeno de sangue. As culturas podem ser expandidas através de várias passagens para gerar milhões de células a partir de uma única amostra de sangue.
Protocol
Representative Results
Discussion
As CBAA são uma poderosa ferramenta que pode ser utilizada em diversas abordagens científicas e terapêuticas 7,8,16. As BOECs têm sido utilizadas para analisar a expressão gênica da CE para elucidar os principais fatores responsáveis pelo desenvolvimento de doenças vasculares e câncer5,19,20,21.</su…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores desejam agradecer o financiamento do NIH/NHLBI R00 HL129068.
Materials
| 19 G needle | Covidien | 1188818112 | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 352098 | |
| 6 well plate | BD Falcon | 353046 | |
| 60 mL syringes | Covidien | 8881560125 | |
| Ammonium chloride solution (0.8%) | Stemcell Technologies | 07850 | |
| Antibiotic/antimycotic solution (100x) | Gibco | 15240-062 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75-253-839 | |
| EGM-2 culture medium | Lonza Walkersville | CC-3162 | |
| Extension tube | Hanna Pharmaceutical Supply Co. | 03382C6227 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlas Biologicals | F-0500-A | |
| Ficoll-Paque 1077 | Cytiva | 17144003 | Density gradient solution |
| Heparin sodium injection (1,000 units/mL) | Pfizer | 00069-0058-01 | |
| Human plasma fibronectin | Gibco | 33016-015 | |
| Ice | N/A | N/A | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Pipette set | Eppendorf | 2231300004 | |
| Sterile water | Gibco | 15230-162 | |
| Thin pipette | Celltreat Scientific | 229280 |
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