2 डी कल्चर सिस्टम में अग्नाशयी बीटा-सेल अग्रदूतों में मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल का भेदभाव
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल प्लानर मोनोलेयर में मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचपीएससी) से प्राप्त अग्नाशयी पूर्वजों में पीडीएक्स 1 और एनकेएक्स 6.1 प्रतिलेखन कारकों की सह-अभिव्यक्ति को बढ़ाने के लिए एक बढ़ी हुई विधि का वर्णन करता है। यह ताजा मैट्रिक्स को फिर से भरने, सेल घनत्व में हेरफेर करने और एंडोडर्मल कोशिकाओं को अलग करके प्राप्त किया जाता है।
Abstract
मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचपीएससी) प्रारंभिक अग्नाशय के विकास का अध्ययन करने और मधुमेह के आनुवंशिक योगदानकर्ताओं की जांच के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण हैं। एचपीएससी-व्युत्पन्न इंसुलिन-स्रावित कोशिकाओं को सेल थेरेपी और रोग मॉडलिंग के लिए उत्पन्न किया जा सकता है, हालांकि, सीमित दक्षता और कार्यात्मक गुणों के साथ। एचपीएससी-व्युत्पन्न अग्नाशयी पूर्वज जो बीटा कोशिकाओं और अन्य अंतःस्रावी कोशिकाओं के अग्रदूत हैं, जब दो प्रतिलेखन कारकों पीडीएक्स 1 और एनकेएक्स 6.1 को सह-व्यक्त करते हैं, तो पूर्वजों को विट्रो और विवो दोनों में कार्यात्मक, इंसुलिन-स्रावित बीटा कोशिकाओं के लिए निर्दिष्ट करते हैं। एचपीएससी-व्युत्पन्न अग्नाशय पूर्वजों का उपयोग वर्तमान में नैदानिक परीक्षणों के हिस्से के रूप में टाइप 1 मधुमेह रोगियों में सेल थेरेपी के लिए किया जाता है। हालांकि, वर्तमान प्रक्रियाएं एनकेएक्स 6.1 और अग्नाशयी पूर्वजों का उच्च अनुपात उत्पन्न नहीं करती हैं, जिससे गैर-कार्यात्मक अंतःस्रावी कोशिकाओं और कुछ ग्लूकोज-उत्तरदायी, इंसुलिन-स्रावित कोशिकाओं का सह-उत्पादन होता है। इस प्रकार इस काम ने एचपीएससी-व्युत्पन्न अग्नाशयी पूर्वजों को उत्पन्न करने के लिए एक बढ़ाया प्रोटोकॉल विकसित किया जो 2 डी मोनोलेयर में पीडीएक्स 1 और एनकेएक्स 6.1 की सह-अभिव्यक्ति को अधिकतम करता है। सेल घनत्व, ताजा मैट्रिक्स की उपलब्धता, और एचपीएससी-व्युत्पन्न एंडोडर्मल कोशिकाओं के पृथक्करण जैसे कारकों को संशोधित किया जाता है जो उत्पन्न अग्नाशय पूर्वजों में पीडीएक्स 1 और एनकेएक्स 6.1 स्तर को बढ़ाते हैं और वैकल्पिक यकृत वंश के लिए प्रतिबद्धता को कम करते हैं। अध्ययन में इस बात पर प्रकाश डाला गया है कि इन विट्रो भेदभाव के दौरान सेल के भौतिक वातावरण में हेरफेर करने से वंश विनिर्देश और जीन अभिव्यक्ति प्रभावित हो सकती है। इसलिए, वर्तमान अनुकूलित प्रोटोकॉल सेल थेरेपी और रोग मॉडलिंग के लिए पीडीएक्स 1 और एनकेएक्स 6.1 सह-व्यक्त पूर्वजों की स्केलेबल पीढ़ी की सुविधा प्रदान करता है।
Introduction
मधुमेह एक जटिल चयापचय विकार है जो विश्व स्तर पर लाखों लोगों को प्रभावित करता है। इंसुलिन के पूरक को मधुमेह के लिए एकमात्र उपचार विकल्प माना जाता है। बीटा सेल रिप्लेसमेंट थेरेपी के साथ अधिक उन्नत मामलों का इलाज किया जाता है, जो या तो पूरे कैडवेरिक अग्न्याशय या आइलेट्स 1,2 के प्रत्यारोपण के माध्यम से प्राप्त किया जाता है। प्रत्यारोपण चिकित्सा को घेरने वाले कई मुद्दे, जैसे ऊतक की उपलब्धता और गुणवत्ता के साथ सीमा, इम्यूनोसप्रेसेन्ट्स की निरंतर आवश्यकता के अलावा प्रत्यारोपण प्रक्रियाओं की आक्रामकता। यह बीटा सेल रिप्लेसमेंट थेरेपी 2,3 के लिए नए और वैकल्पिक विकल्पों की खोज की आवश्यकता है। मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचपीएससी) हाल ही में मानव अग्न्याशय जीव विज्ञान को समझने के लिए एक आशाजनक उपकरण के रूप में उभरे हैं और प्रत्यारोपण चिकित्सा 4,5,6,7 के लिए एक गैर-संपूर्ण और संभावित रूप से अधिक व्यक्तिगत स्रोत के रूप में उभरे हैं। मानव भ्रूण स्टेम सेल (एचईएससी) और मानव-प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचआईपीएससी) सहित एचपीएससी में उच्च आत्म-नवीकरण क्षमता होती है और मानव शरीर के किसी भी ऊतक प्रकार को जन्म देती है। एचईएससी भ्रूण के आंतरिक कोशिका द्रव्यमान से प्राप्त होते हैं, और एचआईपीएससी को किसी भी दैहिक कोशिका 4,8 से पुन: प्रोग्राम किया जाता है।
निर्देशित भेदभाव प्रोटोकॉल को एचपीएससी से अग्नाशयी बीटा कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए अनुकूलित किया जाता है जो क्रमिक रूप से अग्नाशय के विकास चरणों के माध्यम से एचपीएससी को निर्देशित करते हैं। ये प्रोटोकॉल एचपीएससी-व्युत्पन्न आइलेट ऑर्गेनोइड उत्पन्न करते हैं। हालांकि उन्होंने अग्नाशयी बीटा कोशिकाओं के अनुपात को बढ़ाने में बहुत सुधार किया है, प्रोटोकॉल की दक्षता अत्यधिक परिवर्तनशील है। यह एनकेएक्स 6.1 + / इंसुलिन + या सी-पेप्टाइड + कोशिकाओं 5,9,10,11,12,13 के ~ 40% से अधिक नहीं बढ़ता है। हालांकि, उत्पन्न बीटा कोशिकाएं अपने ट्रांसक्रिप्शनल और चयापचय प्रोफाइल और ग्लूकोज 4,5,14 के प्रति उनकी प्रतिक्रिया के संदर्भ मेंवयस्क मानव बीटा कोशिकाओं के समान नहीं हैं। एचपीएससी-व्युत्पन्न बीटा कोशिकाओं में वयस्क मानव आइलेट्स5 की तुलना में पीसीएसके 2, पैक्स 6, यूसीएन 3, एमएएफए, जी 6 पीसी 2 और केसीएनके 3 जैसे प्रमुख बीटा सेल मार्करों की जीन अभिव्यक्ति की कमी होती है। इसके अतिरिक्त, एचपीएससी-व्युत्पन्न बीटा कोशिकाओं ने ग्लूकोज के जवाब में कैल्शियम सिग्नलिंग को कम कर दिया है। वे सह-उत्पन्न पॉलीहार्मोनल कोशिकाओं से दूषित होते हैं जो ग्लूकोजके स्तर को बढ़ाने के जवाब में इंसुलिन की उचित मात्रा का स्राव नहीं करते हैं। दूसरी ओर, एचपीएससी-व्युत्पन्न अग्नाशयी पूर्वज, जो आइलेट अग्रदूत हैं, बीटा कोशिकाओं की तुलना में विट्रो में अधिक कुशलता से उत्पन्न हो सकते हैं और, जब विवो में प्रत्यारोपित किया जाता है, तो कार्यात्मक, इंसुलिन-स्रावित बीटा कोशिकाओं15,16 में परिपक्व हो सकता है। नैदानिक परीक्षण वर्तमान में टी 1 डी विषयों में प्रत्यारोपण पर उनकी सुरक्षा और प्रभावकारिता का प्रदर्शन करने पर केंद्रित हैं।
विशेष रूप से, एक ही अग्नाशयी पूर्वज कोशिका के भीतर प्रतिलेखन कारक पीडीएक्स 1 (अग्नाशय और डुओडेनल होमोबॉक्स 1) और एनकेएक्स 6.1 (एनकेएक्स 6 होमोबॉक्स 1) की अभिव्यक्ति बीटा सेल वंश5 के प्रति प्रतिबद्धता के लिए महत्वपूर्ण है। अग्नाशय के पूर्वज जो एनकेएक्स 6.1 को व्यक्त करने में विफल रहते हैं, पॉलीहार्मोनल अंतःस्रावी कोशिकाओं या गैर-कार्यात्मक बीटा कोशिकाओं को जन्म देते हैं 17,18. इसलिए, अग्नाशय ी पूर्वज चरण में पीडीएक्स 1 और एनकेएक्स 6.1 की एक उच्च सह-अभिव्यक्ति अंततः बड़ी संख्या में कार्यात्मक बीटा कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए आवश्यक है। अध्ययनों से पता चला है कि एक भ्रूणीय शरीर या 3 डी संस्कृति अग्नाशयी पूर्वजों में पीडीएक्स 1 और एनकेएक्स 6.1 को बढ़ाती है जहां विभेदक कोशिकाएं एकत्रित होती हैं, पीडीएक्स 1 + / एनकेएक्स 6.1 + आबादी12,19 के 40% -80% के बीच भिन्न होती हैं। हालांकि, निलंबन संस्कृतियों की तुलना में, 2 डी भेदभाव संस्कृतियां कई सेल लाइनों5 पर आवेदन के लिए अधिक लागत प्रभावी, व्यवहार्य और सुविधाजनक हैं। हमने हाल ही में दिखाया कि मोनोलेयर भेदभाव संस्कृतियां पीडीएक्स 1 + / एनकेएक्स 6.1 + के 90% से अधिक एचपीएससी-व्युत्पन्न अग्नाशयी पूर्वजों20,21,22 को सह-व्यक्त करती हैं। रिपोर्ट की गई विधि ने उत्पन्न अग्नाशयी पूर्वजों को एक उच्च प्रतिकृति क्षमता प्रदान की और यकृत वंश21 जैसे वैकल्पिक भाग्य विनिर्देशों को रोका। इसलिए, यहां, यह प्रोटोकॉल पीडीएक्स 1 और एनकेएक्स 6.1 को सह-व्यक्त करने वाले अग्नाशयी बीटा-सेल अग्रदूतों के लिए एचपीएससी के भेदभाव के लिए एक अत्यधिक कुशल विधि प्रदर्शित करता है। यह विधि एचपीएससी-व्युत्पन्न एंडोडर्म को अलग करने और सेल घनत्व में हेरफेर करने की तकनीक का उपयोग करती है, इसके बाद पीडीएक्स 1 और एनकेएक्स 6.1 सह-अभिव्यक्ति को बढ़ावा देने के लिए एक विस्तारित एफजीएफ और रेटिनोइड सिग्नलिंग के साथ-साथ हेजहोग निषेध (चित्रा 1)। यह विधि प्रत्यारोपण चिकित्सा और रोग मॉडलिंग के लिए एचपीएससी-व्युत्पन्न अग्नाशयी बीटा-सेल अग्रदूतों की एक स्केलेबल पीढ़ी की सुविधा प्रदान कर सकती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह काम पीडीएक्स 1 और एनकेएक्स 6.1 की उच्च सह-अभिव्यक्ति के साथ एचपीएससी से अग्नाशयी पूर्वजों को उत्पन्न करने के लिए एक उन्नत प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। ताजा मैट्रिक्स पर आधे घनत्व पर एचपीएससी-व्युत्पन्…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को कतर नेशनल रिसर्च फंड (क्यूएनआरएफ) (अनुदान संख्या 2011) से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था। एनपीआरपी 10-1221-160041)।
Materials
| 15 mL, conical, centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
| 20X TBS Tween 20 | Thermo Scientific | 28360 | |
| 24-well culture plates, flat bottom with lid | Costar | 3524 | |
| 50 mL, conical, centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339652 | |
| 6- well culture plates, multidish | Thermo Scientific | 140685 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 0-7920 | |
| Activin A | R&D | 338-AC | Reconstituted in 4 mM HCl |
| Anti NKX6.1 antibody, mouse monoclonal | DSHB | F55A12-C | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining |
| Anti-PDX1 antibody, guinea pig polyclonal | Abcam | ab47308 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:1000 for immunostaining |
| B27 minus Vit A | ThermoFisher | 12587010 | |
| Bovine serum albumin, heat shock fraction, fatty acid free | Sigma | A7030 | |
| CHIR 99021 | Tocris | 4423 | Reconstituted in DMSO |
| DMEM, high glucose | ThermoFisher | 41965047 | |
| Donkey anti-Mouse IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10037 | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | A-21206 | ||
| DPBS 1X | ThermoFisher | 14190144 | |
| EGF | ThermoFisher | PHG0313 | Reconstituted in 0.1% BSA in PBS |
| FGF10 | R&D | 345-FG | Reconstituted in PBS |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8644 | |
| Hoechst 33258 | Sigma | 23491-45-4 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX73 | |
| KnockOut DMEM/F-12 (1X) | Gibco | 12660-012 | |
| KnockOut SR serum replacement | Gibco | 10828-028 | |
| L-Ascorbic acid (vitamin C) | Sigma | A92902 | Reconstituted in distilled water |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 354230 | Aliquot the thawed stock and freeze at -20C. |
| MCDB131 | ThermoFisher | 10372019 | |
| Mouse anti-SOX17 | ORIGENE | CF500096 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining |
| mTeSR Plus | Stem Cell Technologies | 85850 | Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use |
| Nalgene filter units, 0.2 µm PES | ThermoFisher | 566-0020 | |
| Nicotinamide | Sigma | 72340 | Reconstituted in distilled water |
| NOGGIN | R&D | 6057-NG | Reconstituted in 0.1% BSA in PBS |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | ChemCruz | sc-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140122 | |
| Portable vacuum aspirator | |||
| Rabbit anti-FOXA2 | Cell signaling technology | 3143 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:500 for immunostaining |
| Retinoic Acid | Sigma Aldrich | R2625 | Reconstituted in DMSO |
| Rock inhibitor (Y-27632) | ReproCell | 04-0012-02 | Reconstituted in DMSO |
| Round Bottom Polystyrene FACS Tubes with Caps, STERILE | Stellar Scientific | FSC-9010 | |
| SANT-1 | Sigma Aldrich | S4572 | Reconstituted in DMSO |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| StemFlex | ThermoFisher | A3349401 | Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use |
| TALI Cellular Analysis Slide | Invitrogen | T10794 | |
| Tali image-based cytometer automated cell counter | Invitrogen | T10796 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
| TrypLE 100 mL | ThermoFisher | 12563011 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 |
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