Differenzierung humaner pluripotenter Stammzellen zu Betazellvorläufern der Bauchspeicheldrüse in einem 2D-Kultursystem
Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt eine verbesserte Methode zur Erhöhung der Koexpression von PDX1- und NKX6.1-Transkriptionsfaktoren in Pankreas-Vorläuferzellen aus humanen pluripotenten Stammzellen (hPS-Zellen) in planaren Monoschichten. Dies wird erreicht, indem die frische Matrix aufgefüllt, die Zelldichte manipuliert und die endodermalen Zellen dissoziiert werden.
Abstract
Humane pluripotente Stammzellen (hPS-Zellen) sind ein hervorragendes Werkzeug, um die frühe Pankreasentwicklung zu untersuchen und die genetischen Beiträge zu Diabetes zu untersuchen. hPSC-abgeleitete insulinsekretierende Zellen können für die Zelltherapie und Krankheitsmodellierung erzeugt werden, jedoch mit begrenzter Effizienz und funktionellen Eigenschaften. hPSC-abgeleitete Pankreas-Vorläuferzellen, die Vorläufer von Betazellen und anderen endokrinen Zellen sind, spezifizieren, wenn sie die beiden Transkriptionsfaktoren PDX1 und NKX6.1 co-exprimieren, die Vorläuferzellen zu funktionellen, Insulin-sezernierenden Betazellen sowohl in vitro als auch in vivo. hPSC-abgeleitete Vorläuferzellen der Bauchspeicheldrüse werden derzeit im Rahmen klinischer Studien für die Zelltherapie bei Typ-1-Diabetes-Patienten eingesetzt. Aktuelle Verfahren erzeugen jedoch keinen hohen Anteil an NKX6.1 und Vorläuferzellen der Bauchspeicheldrüse, was zu einer Kogeneration von nicht-funktionellen endokrinen Zellen und wenigen Glukose-responsiven, Insulin-sekretierenden Zellen führt. Diese Arbeit entwickelte daher ein verbessertes Protokoll zur Erzeugung von hPSC-abgeleiteten Pankreasvorläufern, die die Koexpression von PDX1 und NKX6.1 in einer 2D-Monoschicht maximieren. Die Faktoren wie Zelldichte, Verfügbarkeit frischer Matrix und Dissoziation von hPSC-abgeleiteten endodermalen Zellen werden moduliert, wodurch PDX1- und NKX6.1-Spiegel in den erzeugten Pankreas-Vorläuferzellen erhöht und die Verpflichtung zur alternativen hepatischen Linie minimiert wird. Die Studie zeigt, dass die Manipulation der physischen Umgebung der Zelle während der In-vitro-Differenzierung die Spezifikation der Abstammungslinie und die Genexpression beeinflussen kann. Daher ermöglicht das derzeit optimierte Protokoll die skalierbare Generierung von PDX1- und NKX6.1-co-exprimierenden Vorläuferzellen für die Zelltherapie und Krankheitsmodellierung.
Introduction
Diabetes ist eine komplexe Stoffwechselstörung, von der Millionen von Menschen weltweit betroffen sind. Die Supplementierung von Insulin gilt als einzige Behandlungsoption für Diabetes. Fortgeschrittenere Fälle werden mit einer Betazellersatztherapie behandelt, die durch Transplantation entweder der ganzen Kadaver-Bauchspeicheldrüse oder der Inselnerreicht wird 1,2. Mehrere Probleme umgeben die Transplantationstherapie, wie die Einschränkung der Verfügbarkeit und Qualität des Gewebes, die Invasivität von Transplantationsverfahren sowie der kontinuierliche Bedarf an Immunsuppressiva. Dies erfordert die Entdeckung neuer und alternativer Optionen für die Betazellersatztherapie 2,3. Humane pluripotente Stammzellen (hPS-Zellen) haben sich kürzlich als vielversprechendes Werkzeug für das Verständnis der menschlichen Pankreasbiologie und als nicht erschöpfende und potenziell personalisiertere Quelle für die Transplantationstherapie erwiesen 4,5,6,7. hPS-Zellen, einschließlich humaner embryonaler Stammzellen (hES-Zellen) und human-induzierter pluripotenter Stammzellen (hiPS-Zellen), haben eine hohe Selbsterneuerungskapazität und führen zu jedem Gewebetyp des menschlichen Körpers. hES-Zellen werden aus der inneren Zellmasse des Embryos abgeleitet, und hiPS-Zellen werden aus jeder somatischen Zelleumprogrammiert 4,8.
Gerichtete Differenzierungsprotokolle sind optimiert, um Betazellen der Bauchspeicheldrüse aus hPS-Zellen zu erzeugen, die hPS-Zellen invitro sequentiell durch pankreas-Entwicklungsstadien leiten. Diese Protokolle erzeugen hPSC-abgeleitete Inselorganoide. Während sie den Anteil der Betazellen der Bauchspeicheldrüse stark verbessert haben, ist die Effizienz der Protokolle sehr variabel. Es steigt nicht auf mehr als ~40% von NKX6.1+/INSULIN+ oder C-PEPTIDE + Zellen 5,9,10,11,12,13. Die erzeugten Betazellen sind jedoch hinsichtlich ihrer transkriptionellen und metabolischen Profile und ihrer Reaktion auf Glukose 4,5,14 nicht vollständig identisch mit den adulten menschlichen Betazellen. Den hPSC-abgeleiteten Betazellen fehlt die Genexpression von wichtigen Betazellmarkern wie PCSK2, PAX6, UCN3, MAFA, G6PC2 und KCNK3 im Vergleich zu erwachsenen menschlichen Inseln5. Darüber hinaus haben die hPSC-abgeleiteten Betazellen eine verminderte Kalziumsignalisierung als Reaktion auf Glukose. Sie sind mit den kogenerierten polyhormonellen Zellen kontaminiert, die als Reaktion auf steigende Glukosespiegelkeine angemessenen Mengen an Insulin absondern5. Auf der anderen Seite könnten hPSC-abgeleitete Pankreas-Vorläuferzellen, die Inselvorläufer sind, in vitro effizienter erzeugt werden als Betazellen und könnten, wenn sie in vivo transplantiert werden, zu funktionellen, Insulin-sekretierenden Betazellen heranreifen15,16. Klinische Studien konzentrieren sich derzeit darauf, ihre Sicherheit und Wirksamkeit bei der Transplantation bei T1D-Probanden nachzuweisen.
Insbesondere die Expression der Transkriptionsfaktoren PDX1 (Pankreas- und Zwölffingerdarm-Homöobox 1) und NKX6.1 (NKX6 Homöobox 1) innerhalb derselben Pankreas-Vorläuferzelle ist entscheidend für das Engagement für eine Betazelllinie5. Vorläuferzellen der Bauchspeicheldrüse, die NKX6.1 nicht exprimieren, führen zu polyhormonellen endokrinen Zellen oder nicht-funktionellen Betazellen17,18. Daher ist eine hohe Co-Expression von PDX1 und NKX6.1 im Pankreas-Vorläuferstadium essentiell, um letztendlich eine große Anzahl funktioneller Betazellen zu erzeugen. Studien haben gezeigt, dass ein embryoider Körper oder eine 3D-Kultur PDX1 und NKX6.1 in Vorläuferzellen der Bauchspeicheldrüse verstärkt, bei denen die differenzierenden Zellen aggregiert sind, wobei sie zwischen 40% und 80% der PDX1+/NKX6.1+-Populationvariieren 12,19. Im Vergleich zu Suspensionskulturen sind 2D-Differenzierungskulturen jedoch kostengünstiger, praktikabler und bequemer für die Anwendung auf mehreren Zelllinien5. Wir haben kürzlich gezeigt, dass Monolayer-Differenzierungskulturen mehr als bis zu 90% der PDX1+/NKX6.1+ co-exprimierenden hPSC-abgeleiteten Pankreas-Vorläuferzellen20,21,22 liefern. Die berichtete Methode verlieh den erzeugten Vorläuferzellen der Bauchspeicheldrüse eine hohe Replikationskapazität und verhinderte alternative Schicksalsspezifikationen wie die hepatische Linie21. Daher demonstriert dieses Protokoll hierin eine hocheffiziente Methode zur Differenzierung von hPSCs zu Betazellvorläufern der Bauchspeicheldrüse, die PDX1 und NKX6.1 koexprimieren. Diese Methode verwendet die Technik der Dissoziation von hPSC-abgeleitetem Endoderm und der Manipulation der Zelldichte, gefolgt von einer erweiterten FGF- und Retinoid-Signalisierung sowie einer Hedgehog-Hemmung, um die PDX1- und NKX6.1-Koexpression zu fördern (Abbildung 1). Diese Methode kann eine skalierbare Generierung von hPSC-abgeleiteten Betazellvorläufern der Bauchspeicheldrüse für die Transplantationstherapie und Krankheitsmodellierung ermöglichen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Arbeit beschreibt ein erweitertes Protokoll zur Erzeugung von Pankreas-Vorläuferzellen aus hPS-Zellen mit einer hohen Co-Expression von PDX1 und NKX6.1. Die Dissoziation und Replattierung des hPSC-abgeleiteten Endoderms bei halber Dichte auf frischer Matrix führte zu einem höheren PDX1 und NKX6.1 in hPSC-abgeleiteten Pankreasvorläufern.
Obwohl der Wachstumsfaktor-Cocktail für jedes Stadium P1-ND 27 sehr ähnlich ist, wurde gezeigt, dass eine erweiterte Behandlung im Stadium 3, einsc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium des Qatar National Research Fund (QNRF) finanziert (Grant No. NPRP10-1221-160041).
Materials
| 15 mL, conical, centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
| 20X TBS Tween 20 | Thermo Scientific | 28360 | |
| 24-well culture plates, flat bottom with lid | Costar | 3524 | |
| 50 mL, conical, centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339652 | |
| 6- well culture plates, multidish | Thermo Scientific | 140685 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 0-7920 | |
| Activin A | R&D | 338-AC | Reconstituted in 4 mM HCl |
| Anti NKX6.1 antibody, mouse monoclonal | DSHB | F55A12-C | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining |
| Anti-PDX1 antibody, guinea pig polyclonal | Abcam | ab47308 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:1000 for immunostaining |
| B27 minus Vit A | ThermoFisher | 12587010 | |
| Bovine serum albumin, heat shock fraction, fatty acid free | Sigma | A7030 | |
| CHIR 99021 | Tocris | 4423 | Reconstituted in DMSO |
| DMEM, high glucose | ThermoFisher | 41965047 | |
| Donkey anti-Mouse IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10037 | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | A-21206 | ||
| DPBS 1X | ThermoFisher | 14190144 | |
| EGF | ThermoFisher | PHG0313 | Reconstituted in 0.1% BSA in PBS |
| FGF10 | R&D | 345-FG | Reconstituted in PBS |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8644 | |
| Hoechst 33258 | Sigma | 23491-45-4 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX73 | |
| KnockOut DMEM/F-12 (1X) | Gibco | 12660-012 | |
| KnockOut SR serum replacement | Gibco | 10828-028 | |
| L-Ascorbic acid (vitamin C) | Sigma | A92902 | Reconstituted in distilled water |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 354230 | Aliquot the thawed stock and freeze at -20C. |
| MCDB131 | ThermoFisher | 10372019 | |
| Mouse anti-SOX17 | ORIGENE | CF500096 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining |
| mTeSR Plus | Stem Cell Technologies | 85850 | Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use |
| Nalgene filter units, 0.2 µm PES | ThermoFisher | 566-0020 | |
| Nicotinamide | Sigma | 72340 | Reconstituted in distilled water |
| NOGGIN | R&D | 6057-NG | Reconstituted in 0.1% BSA in PBS |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | ChemCruz | sc-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140122 | |
| Portable vacuum aspirator | |||
| Rabbit anti-FOXA2 | Cell signaling technology | 3143 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:500 for immunostaining |
| Retinoic Acid | Sigma Aldrich | R2625 | Reconstituted in DMSO |
| Rock inhibitor (Y-27632) | ReproCell | 04-0012-02 | Reconstituted in DMSO |
| Round Bottom Polystyrene FACS Tubes with Caps, STERILE | Stellar Scientific | FSC-9010 | |
| SANT-1 | Sigma Aldrich | S4572 | Reconstituted in DMSO |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| StemFlex | ThermoFisher | A3349401 | Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use |
| TALI Cellular Analysis Slide | Invitrogen | T10794 | |
| Tali image-based cytometer automated cell counter | Invitrogen | T10796 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
| TrypLE 100 mL | ThermoFisher | 12563011 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 |
References
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