Summary

Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток человека в предшественники бета-клеток поджелудочной железы в системе 2D-культур

Published: December 16, 2021
doi:

Summary

Настоящий протокол описывает усовершенствованный метод увеличения коэкспрессии факторов транскрипции PDX1 и NKX6.1 в предшественниках поджелудочной железы, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSCs) в планарных монослоях. Это достигается путем пополнения свежей матрицы, манипулирования плотностью клеток и диссоциации эндодермальных клеток.

Abstract

Человеческие плюрипотентные стволовые клетки (hPSCs) являются отличным инструментом для изучения раннего развития поджелудочной железы и исследования генетических факторов диабета. Клетки, полученные из hPSC инсулина, могут быть получены для клеточной терапии и моделирования заболеваний, однако, с ограниченной эффективностью и функциональными свойствами. hPSC-производные предшественники поджелудочной железы, которые являются предшественниками бета-клеток и других эндокринных клеток, при совместной экспрессии двух факторов транскрипции PDX1 и NKX6.1 указывают предшественников функциональных, инсулин-секретирующих бета-клеток как in vitro , так и in vivo. Предшественники поджелудочной железы, полученные из hPSC, в настоящее время используются для клеточной терапии у пациентов с диабетом 1 типа в рамках клинических испытаний. Однако современные процедуры не генерируют высокую долю NKX6.1 и предшественников поджелудочной железы, что приводит к когенерации нефункциональных эндокринных клеток и нескольких чувствительных к глюкозе, инсулин-секретирующих клеток. Таким образом, эта работа разработала расширенный протокол для генерации прародителей поджелудочной железы, полученных из hPSC, которые максимизируют совместную экспрессию PDX1 и NKX6.1 в 2D-монослое. Такие факторы, как плотность клеток, наличие свежей матрицы и диссоциация эндодермальных клеток, полученных из hPSC, модулируются, что увеличивает уровни PDX1 и NKX6.1 в генерируемых предшественниках поджелудочной железы и сводит к минимуму приверженность альтернативной печеночной линии. Исследование подчеркивает, что манипулирование физической средой клетки во время дифференцировки in vitro может повлиять на спецификацию родословной и экспрессию генов. Таким образом, текущий оптимизированный протокол облегчает масштабируемую генерацию коэкспрессионных предшественников PDX1 и NKX6.1 для клеточной терапии и моделирования заболеваний.

Introduction

Диабет является сложным метаболическим расстройством, затрагивающим миллионы людей во всем мире. Добавление инсулина считается единственным вариантом лечения диабета. Более продвинутые случаи лечатся бета-клеточной заместительной терапией, достигаемой путем трансплантации либо целой трупной поджелудочной железы, либо островков 1,2. Несколько вопросов связаны с трансплантационной терапией, такие как ограничение доступности и качества ткани, инвазивность процедур трансплантации в дополнение к постоянной потребности в иммунодепрессантах. Это обусловливает необходимость открытия новых и альтернативных вариантов бета-клеточной заместительной терапии 2,3. Человеческие плюрипотентные стволовые клетки (hPSCs) недавно стали многообещающим инструментом для понимания биологии поджелудочной железы человека и неисчерпывающим и потенциально более персонализированным источником для трансплантационной терапии 4,5,6,7. hPSCs, включая человеческие эмбриональные стволовые клетки (hESCs) и индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (hiPSCs), обладают высокой способностью к самообновлению и дают начало любому типу тканей человеческого тела. hESCs получают из внутренней клеточной массы эмбриона, а hiPSCs перепрограммируются из любой соматической клетки 4,8.

Протоколы направленной дифференцировки оптимизированы для генерации бета-клеток поджелудочной железы из hPSCs, которые последовательно направляют hPSCs через стадии развития поджелудочной железы invitro. Эти протоколы генерируют островковые органоиды, полученные из hPSC. Хотя они значительно улучшились в увеличении доли бета-клеток поджелудочной железы в них, эффективность протоколов сильно варьируется. Он не увеличивается до более чем ~40% NKX6.1+/INSULIN+ или C-PEPTIDE + клеток 5,9,10,11,12,13. Однако генерируемые бета-клетки не полностью идентичны бета-клеткам взрослого человека с точки зрения их транскрипционных и метаболических профилей и их реакции на глюкозу 4,5,14. Бета-клеткам, полученным из hPSC, отсутствует экспрессия генов ключевых маркеров бета-клеток, таких как PCSK2, PAX6, UCN3, MAFA, G6PC2 и KCNK3 по сравнению с островками5 взрослых людей. Кроме того, бета-клетки, полученные из hPSC, уменьшают передачу сигналов кальция в ответ на глюкозу. Они загрязнены совместно генерируемыми полигормональными клетками, которые не секретируют соответствующее количество инсулина в ответ на повышение уровня глюкозы5. С другой стороны, производные от hPSC предшественники поджелудочной железы, которые являются предшественниками островков, могут генерироваться более эффективно in vitro по сравнению с бета-клетками и при трансплантации in vivo могут созревать в функциональные, секретирующие инсулин бета-клетки15,16. Клинические испытания в настоящее время сосредоточены на демонстрации их безопасности и эффективности при трансплантации у субъектов СД1.

Примечательно, что экспрессия транскрипционных факторов PDX1 (панкреатический и дуоденальный гомеобокс 1) и NKX6.1 (NKX6 Homeobox 1) в пределах одной и той же клетки-предшественника поджелудочной железы имеет решающее значение для приверженности бета-клеточной линии5. Предшественники поджелудочной железы, которые не экспрессируют NKX6.1, дают начало полигормональным эндокринным клеткам или нефункциональным бета-клеткам17,18. Таким образом, высокая коэкспрессия PDX1 и NKX6.1 на стадии предшественника поджелудочной железы необходима для получения в конечном итоге большого количества функциональных бета-клеток. Исследования показали, что эмбриоидное тело или 3D-культура усиливает PDX1 и NKX6.1 в предшественниках поджелудочной железы, где дифференцирующие клетки агрегируются, варьируясь между 40%-80% PDX1 + / NKX6.1 + популяции12,19. Однако, по сравнению с культурами суспензии, культуры 2D-дифференцировки являются более экономически эффективными, осуществимыми и удобными для применения на нескольких клеточных линиях5. Недавно мы показали, что монослойные дифференцировочные культуры дают более 90% PDX1+/NKX6.1+, коэкспрессирующих hPSC-производных предшественников поджелудочной железы 20,21,22. Сообщенный способ придавал высокую реплицирующую способность генерируемым прародителям поджелудочной железы и предотвращал альтернативные спецификации судьбы, такие как печеночная линия21. Таким образом, в настоящем описании данный протокол демонстрирует высокоэффективный способ дифференцировки гПСК к предшественникам бета-клеток поджелудочной железы, совместно экспрессирующим PDX1 и NKX6.1. Этот метод использует технику диссоциации эндодермы, полученной из hPSC, и манипулирования плотностью клеток с последующей расширенной передачей сигналов FGF и ретиноидов, а также ингибированием Hedgehog для стимулирования коэкспрессии PDX1 и NKX6.1 (рисунок 1). Этот метод может способствовать масштабируемой генерации прекурсоров бета-клеток поджелудочной железы, полученных из hPSC, для трансплантационной терапии и моделирования заболеваний.

Protocol

Исследование было одобрено соответствующим институциональным комитетом по этике исследований и выполнено в соответствии с этическими стандартами, изложенными в Хельсинкской декларации 1964 года и ее более поздних поправках или сопоставимых этических стандартах. Протокол был одобрен …

Representative Results

Результаты показывают, что оптимизированный протокол P2-D (рис. 1A) повысил эффективность дифференцировки предшественников поджелудочной железы путем повышения регуляции совместной экспрессии PDX1 и NKX6.1 (рисунок 2A, B и рисунок 3A). В ?…

Discussion

В данной работе описан усовершенствованный протокол генерации предшественников поджелудочной железы из гПСК с высокой коэкспрессией PDX1 и NKX6.1. Диссоциация и повторное покрытие эндодермы, полученной из hPSC, при половинной плотности на свежей матрице привели к повышению PDX1 и NKX6.1 у предше…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа финансировалась за счет гранта Катарского национального исследовательского фонда (QNRF) (грант No. НПРП10-1221-160041).

Materials

15 mL, conical, centrifuge tubes Thermo Scientific 339651
20X TBS Tween 20 Thermo Scientific 28360
24-well culture plates, flat bottom with lid Costar 3524
50 mL, conical, centrifuge tubes Thermo Scientific 339652
6- well culture plates, multidish Thermo Scientific 140685
Accutase Stem Cell Technologies 0-7920
Activin A R&D 338-AC Reconstituted in 4 mM HCl
Anti NKX6.1 antibody, mouse monoclonal DSHB F55A12-C Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining
Anti-PDX1 antibody, guinea pig polyclonal Abcam ab47308 Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:1000 for immunostaining
B27 minus Vit A ThermoFisher 12587010
Bovine serum albumin, heat shock fraction, fatty acid free Sigma A7030
CHIR 99021 Tocris 4423 Reconstituted in DMSO
DMEM, high glucose ThermoFisher 41965047
Donkey anti-Mouse IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 Invitrogen A10037
Donkey anti-Rabbit IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 A-21206
DPBS 1X ThermoFisher 14190144
EGF ThermoFisher PHG0313 Reconstituted in 0.1% BSA in PBS
FGF10 R&D 345-FG Reconstituted in PBS
Glucose Sigma Aldrich G8644
Hoechst 33258 Sigma 23491-45-4
Inverted microscope Olympus IX73
KnockOut DMEM/F-12 (1X) Gibco 12660-012
KnockOut SR serum replacement Gibco 10828-028
L-Ascorbic acid (vitamin C) Sigma A92902 Reconstituted in distilled water
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix Corning 354230 Aliquot the thawed stock and freeze at -20C.
MCDB131 ThermoFisher 10372019
Mouse anti-SOX17 ORIGENE CF500096 Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining
mTeSR Plus Stem Cell Technologies 85850 Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use
Nalgene filter units, 0.2 µm PES ThermoFisher 566-0020
Nicotinamide Sigma 72340 Reconstituted in distilled water
NOGGIN R&D 6057-NG Reconstituted in 0.1% BSA in PBS
Paraformaldehyde solution 4% in PBS ChemCruz sc-281692
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher 15140122
Portable vacuum aspirator
Rabbit anti-FOXA2 Cell signaling technology 3143 Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:500 for immunostaining
Retinoic Acid Sigma Aldrich R2625 Reconstituted in DMSO
Rock inhibitor (Y-27632) ReproCell 04-0012-02 Reconstituted in DMSO
Round Bottom Polystyrene FACS Tubes with Caps, STERILE Stellar Scientific FSC-9010
SANT-1 Sigma Aldrich S4572 Reconstituted in DMSO
Sodium bicarbonate Sigma S5761-500G
StemFlex ThermoFisher A3349401 Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use
TALI Cellular Analysis Slide Invitrogen T10794
Tali image-based cytometer automated cell counter Invitrogen T10796
Triton X-100 Sigma 9002-93-1
TrypLE 100 mL ThermoFisher 12563011
Tween 20 Sigma P2287
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Invitrogen 15575-038

References

  1. Rickels, M. R., Robertson, R. P. Pancreatic islet transplantation in humans: Recent progress and future directions. Endocrine Reviews. 40 (2), 631-668 (2019).
  2. Latres, E., Finan, D. A., Greenstein, J. L., Kowalski, A., Kieffer, T. J. Navigating two roads to glucose normalization in diabetes: Automated insulin delivery devices and cell therapy. Cell Metabolism. 29 (3), 545-563 (2019).
  3. Vaithilingam, V., Tuch, B. E. Islet transplantation and encapsulation: An update on recent developments. Review of Diabetic Studies. 8 (1), 51-67 (2011).
  4. Abdelalim, E. M. Modeling different types of diabetes using human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (6), 2459-2483 (2021).
  5. Memon, B., Abdelalim, E. M. Stem cell therapy for diabetes: Beta cells versus pancreatic progenitors. Cells. 9 (2), 283 (2020).
  6. Balboa, D., Iworima, D. G., Kieffer, T. J. Human pluripotent stem cells to model islet defects in diabetes. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 12, 642152 (2021).
  7. Gaertner, B., Carrano, A. C., Sander, M. Human stem cell models: Lessons for pancreatic development and disease. Genes & Development. 33 (21-22), 1475-1490 (2019).
  8. Abdelalim, E. M., Bonnefond, A., Bennaceur-Griscelli, A., Froguel, P. Pluripotent stem cells as a potential tool for disease modelling and cell therapy in diabetes. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 327-337 (2014).
  9. Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
  10. Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
  11. Nair, G. G., et al. Recapitulating endocrine cell clustering in culture promotes maturation of human stem-cell-derived β cells. Nature Cell Biology. 21 (2), 263-274 (2019).
  12. Russ, H. A., et al. Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).
  13. Veres, A., et al. Charting cellular identity during human in vitro β-cell differentiation. Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).
  14. Hrvatin, S., et al. Differentiated human stem cells resemble fetal, not adult, β cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3038-3043 (2014).
  15. Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).
  16. Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells Journal. 31 (11), 2432-2442 (2013).
  17. Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells Journal. 31 (11), 2432-2442 (2013).
  18. Bruin, J. E., et al. Characterization of polyhormonal insulin-producing cells derived in vitro from human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 12 (1), 194-208 (2014).
  19. Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
  20. Memon, B., Abdelalim, E. M. Highly efficient differentiation of human pluripotent stem cells into pancreatic progenitors co-expressing PDX1 and NKX6.1. Methods in Molecular Biology. , (2020).
  21. Memon, B., Karam, M., Al-Khawaga, S., Abdelalim, E. M. Enhanced differentiation of human pluripotent stem cells into pancreatic progenitors co-expressing PDX1 and NKX6.1. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 15 (2018).
  22. Aigha, I. I., Memon, B., Elsayed, A. K., Abdelalim, E. M. Differentiation of human pluripotent stem cells into two distinct NKX6.1 populations of pancreatic progenitors. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 83 (2018).
  23. Ali, G., et al. Keratinocytes derived from patient-specific induced pluripotent stem cells recapitulate the genetic signature of psoriasis disease. Stem Cells and Development. 29 (7), 383-400 (2020).
  24. Elsayed, A. K., et al. Generation of a human induced pluripotent stem cell line (QBRIi009-A) from a patient with a heterozygous deletion of FOXA2. Stem Cell Research. 42, 101705 (2020).
  25. Davenport, C., Diekmann, U., Budde, I., Detering, N., Naujok, O. Anterior-posterior patterning of definitive endoderm generated from human embryonic stem cells depends on the differential signaling of retinoic acid, Wnt-, and BMP-signaling. Stem Cells. 34 (11), 2635-2647 (2016).
  26. Schroeder, I. S., et al. Induction and selection of Sox17-expressing endoderm cells generated from murine embryonic stem cells. Cells Tissues Organs. 195 (6), 507-523 (2012).
  27. Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
  28. Elsayed, A. K., Younis, I., Ali, G., Hussain, K., Abdelalim, E. M. Aberrant development of pancreatic beta cells derived from human iPSCs with FOXA2 deficiency. Cell Death & Disease. 12 (1), 103 (2021).
  29. Mfopou, J. K., Chen, B., Mateizel, I., Sermon, K., Bouwens, L. Noggin, retinoids, and fibroblast growth factor regulate hepatic or pancreatic fate of human embryonic stem cells. Gastroenterology. 138 (7), 1-14 (2010).
  30. Mfopou, J. K., De Groote, V., Xu, X., Heimberg, H., Bouwens, L. Sonic hedgehog and other soluble factors from differentiating embryoid bodies inhibit pancreas development. Stem Cells. 25 (5), 1156-1165 (2007).
  31. Gattazzo, F., Urciuolo, A., Bonaldo, P. Extracellular matrix: A dynamic microenvironment for stem cell niche. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (8), 2506-2519 (2014).
  32. Watt, F. M., Huck, W. T. Role of the extracellular matrix in regulating stem cell fate. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (8), 467-473 (2013).
  33. Shih, H. P., Panlasigui, D., Cirulli, V., Sander, M. ECM signaling regulates collective cellular dynamics to control pancreas branching morphogenesis. Cell Reports. 14 (2), 169-179 (2016).
  34. Raza, A., Ki, C. S., Lin, C. C. The influence of matrix properties on growth and morphogenesis of human pancreatic ductal epithelial cells in 3D. Biomaterials. 34 (21), 5117-5127 (2013).
  35. Lin, H. Y., et al. Fibronectin and laminin promote differentiation of human mesenchymal stem cells into insulin producing cells through activating Akt and ERK. Journal of Biomedical Science. 17, 56 (2010).
  36. Boretti, M. I., Gooch, K. J. Effect of extracellular matrix and 3D morphogenesis on islet hormone gene expression by Ngn3-infected mouse pancreatic ductal epithelial cells. Tissue Engineering Part A. 14 (12), 1927-1937 (2008).
  37. Boretti, M. I., Gooch, K. J. Induced cell clustering enhances islet beta cell formation from human cultures enriched for pancreatic ductal epithelial cells. Tissue Engineering. 12 (4), 939-948 (2006).
  38. Beattie, G. M., Rubin, J. S., Mally, M. I., Otonkoski, T., Hayek, A. Regulation of proliferation and differentiation of human fetal pancreatic islet cells by extracellular matrix, hepatocyte growth factor, and cell-cell contact. Diabetes. 45 (9), 1223-1228 (1996).
  39. Gage, B. K., Webber, T. D., Kieffer, T. J. Initial cell seeding density influences pancreatic endocrine development during in vitro differentiation of human embryonic stem cells. PLoS One. 8 (12), 82076 (2013).

Play Video

Cite This Article
Memon, B., Abdelalim, E. M. Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells Into Pancreatic Beta-Cell Precursors in a 2D Culture System. J. Vis. Exp. (178), e63298, doi:10.3791/63298 (2021).

View Video