Summary
Il protocollo consente la generazione di una popolazione di adipociti puri da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). L'acido retinoico viene utilizzato per differenziare le iPSC in cellule staminali mesenchimali (MSC) utilizzate per la produzione di adipociti. Quindi, viene utilizzato un approccio di selezione basato sulla colorazione rossa del Nilo per ottenere adipociti puri.
Abstract
I recenti progressi nella tecnologia delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) hanno permesso la generazione di diversi tipi di cellule, compresi gli adipociti. Tuttavia, gli attuali metodi di differenziazione hanno una bassa efficienza e non producono una popolazione omogenea di adipociti. Qui, eludiamo questo problema utilizzando un metodo basato sul retinoico completamente trans per produrre cellule staminali mesenchimali (MSC) ad alto rendimento. Regolando i percorsi che regolano la proliferazione, la sopravvivenza e l'adesione cellulare, la nostra strategia di differenziazione consente la generazione efficiente di corpi embrionali (EB) che si differenziano in una popolazione pura di MSC multipotenti. L'elevato numero di MSC generate da questo metodo fornisce una fonte ideale per la generazione di adipociti. Tuttavia, l'eterogeneità del campione derivante dalla differenziazione degli adipociti rimane una sfida. Pertanto, abbiamo utilizzato un metodo a base di rosso del Nilo per purificare gli adipociti maturi portatori di lipidi utilizzando FACS. Questa strategia di selezione ci ha permesso di stabilire un modo affidabile per modellare i disordini metabolici associati agli adipociti utilizzando un pool di adipociti con ridotta eterogeneità del campione e funzionalità cellulare migliorata.
Introduction
Le cellule staminali mesenchimali (MSC) agiscono come un'efficace risorsa transitoria per la produzione di cellule di origine mesodermica come adipociti, osteociti e condrociti, che potrebbero essere ulteriormente utilizzate per modellare le rispettive malattie genetiche. Tuttavia, gli approcci precedenti si basavano sul raggiungimento di queste MSC da tessuti adulti 1, il che imponeva la sfida di ottenerle in numero elevato dai donatori e la limitazione di mantenerle funzionalmente vitali in condizioni di coltura in vitro non ottimali 1,2. Questi ostacoli hanno prodotto una grande richiesta di avere un protocollo per la generazione di MSC in vitro. Le cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) possono essere utilizzate come preziosa fonte di MSC, presentando caratteristiche MSC 3,4,5. Le MSC derivate da iPSCs possono essere utilizzate come opzione terapeutica in diverse malattie. Inoltre, la capacità delle MSC derivate da iPSC di generare adipociti, le rende un prezioso modello umano in vitro per studiare l'adipogenesi umana, l'obesità e i disturbi associati agli adipociti.
Gli attuali protocolli di differenziazione degli adipociti possono essere classificati in due gruppi, uno dei quali coinvolge la differenziazione degli adipociti utilizzando cocktail chimici o a base proteica che danno una resa risultante del 30% -60% 6,7,8,9, mentre l'altro che coinvolge la manipolazione genetica per una robusta induzione dei fattori chiave di trascrizione che governano lo sviluppo degli adipociti per ottenere una resa dell'80% -90% 10, 11. Tuttavia, la manipolazione genetica non ricapitola il naturale processo di differenziazione degli adipociti e spesso maschera i sottili paradigmi che arrivano durante l'adipogenesi, rendendola inefficace ai fini della modellizzazione della malattia12,13. Pertanto, presentiamo un modo per ordinare gli adipociti maturi di derivazione chimica da quelli immaturi etichettando in modo fluorescente gli adipociti portatori di lipidi usando il rosso del Nilo.
Qui presentiamo un protocollo che prevede l'incubazione transitoria di corpi embrioidi derivati da iPSCs (EB) con acido retinoico all-trans per produrre un elevato numero di MSC in rapida proliferazione, che potrebbero essere ulteriormente utilizzati per generare adipociti14. Presentiamo anche un modo per ordinare gli adipociti maturi di derivazione chimica dal pool di differenziazione eterogenea etichettando fluorescentmente le loro goccioline lipidiche usando un colorante lipofilo; Rosso Nilo. Ciò consentirebbe la generazione di una popolazione pura di adipociti maturi con funzionalità migliorata per modellare accuratamente i disturbi metabolici associati agli adipociti.
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Protocol
Lo studio è stato approvato dal comitato etico di ricerca istituzionale competente ed eseguito seguendo gli standard etici stabiliti nella Dichiarazione di Helsinki del 1964 e nei suoi successivi emendamenti o standard etici comparabili. Il protocollo è stato approvato dall'Institutional Review Board (IRB) di HMC (n. 16260/16) e QBRI (n. 2016-003). Questo lavoro è ottimizzato anche per hESC come H1 e H9. I campioni di sangue sono stati ottenuti da individui sani con pieno consenso informato. Le iPSC sono generate da cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) di individui sani.
1. Coltura e mantenimento delle iPSC
- Preparare le piastre rivestite con matrice di membrana basale ricostituendo la matrice di rivestimento in DMEM knockout in un rapporto di 1:80 e conservare a 4 °C.
- Preparare i terreni di coltura per iPSC aggiungendo 50 ml di 10 volte i terreni di integrazione delle cellule staminali a 500 ml di terreni basali delle cellule staminali, insieme a 5 ml di 100 volte la penicillina-streptomicina (P/S) e conservare a 4 °C per un breve termine o a -20 °C per l'uso a lungo termine.
- Foderare le piastre con una matrice di rivestimento - 1 mL per una piastra a 6 pozzetti, 500 μL per una piastra a 12 pozzetti, 250 μL per una piastra da 24 pozzetti - e incubare la piastra a 37 °C per 1-2 ore.
- Rimuovere un'aliquota di terreni di coltura iPSCs e preriscaldare a temperatura ambiente prima dell'uso.
- Scongelare un flaconcino di iPSC (ESC o iPSC) a bagnomaria a 37 °C e trasferirlo in un tubo conico da 15 mL contenente 2-3 mL di terreno di coltura.
- Centrifugare il tubo a 120 x g per 4 minuti a temperatura ambiente (RT-23 °C).
- Rimuovere il surnatante e aggiungere 2 ml di terreno di coltura fresco integrato con inibitore di 10 μM ROCK (Y-27632). Placcare le celle in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti rivestita di matrice e posizionare la piastra a 37 °C.
- Dopo 24 ore, rimuovere il supporto e sostituirlo con nuovi terreni di coltura.
- Cambiare il supporto ogni giorno fino a quando le celle raggiungono l'80% -90% di confluenza.
- Al raggiungimento della confluenza, le celle di passaggio seguendo i passaggi descritti di seguito.
- Rimuovere il mezzo e lavare le cellule con soluzione salina tamponata fosfato di Dulbecco (DPBS).
- Aggiungere il reagente di dissociazione delle iPSC (vedere la tabella dei materiali) - 500 μL per un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti, 250 μL per un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti - e incubare per 1 minuto a 37 °C.
- Rimuovere il reagente di dissociazione e incubare le cellule asciutte per 1 minuto a 37 °C.
- Raccogliere le cellule usando terreni di coltura - 1 ml per un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e 250 μL per un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti - in un tubo conico da 15 ml e centrifugare a 120 x g per 4 minuti.
- Risospendere le cellule in terreni di coltura-2 ml per un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e 500 μL per un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti integrata con inibitore ROCK 10 μM e placcarle su piastre rivestite di matrice fresca a confluenza del 40%.
2. Differenziazione delle iPSC in MSC
- Preparare i terreni di differenziazione MSC aggiungendo il 15% di siero bovino fetale (FBS) e l'1% di P/S a basso glucosio DMEM + piruvato e conservare a 4 °C.
- Al raggiungimento dell'80% di confluenza, utilizzare le iPSC per la formazione del corpo embrioide (EB) seguendo i passaggi descritti di seguito.
- Lavare le cellule con DPBS e incubarle con mezzo di dissociazione / EDTA-500 μL per un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti, 250 μL per un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti.
- Incubare a 37 °C per 1 minuto, aspirare il reagente di dissociazione e mantenere le cellule a 37 °C per un ulteriore 1 minuto. Per iniziare la differenziazione MSC, sono necessarie ~10-12 x 106 celle.
- Raccogliere le cellule in un tubo conico da 15 mL utilizzando terreni di coltura. Assicurati di essere molto delicato durante la raccolta per evitare che le cellule diventino singole e consentire la formazione di EB. Centrifugare le celle a 120 x g per 4 minuti.
- Risospendere le cellule in 3 mL di mezzi di differenziazione MSC contenenti 10 μM di inibitore ROCK.
- Mescolare e distribuire 0,5 ml/pozzetto in una piastra di fissaggio ultra-bassa da 24 pozzetti.
NOTA: L'uso di una piastra di attacco ultra-bassa incoraggerebbe l'aggregazione cellulare in EB piuttosto che il loro attaccamento sulla superficie. - Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 °C.
- Dopo 24 ore, indurre gli EB raggiunti con trattamento con acido retinoico (RA) seguendo i passaggi descritti di seguito.
- Aggiungere 10 μM RA a 3 mL di mezzi di differenziazione MSC. Raccogliere gli EB in un tubo da 15 ml e lasciarli riposare per 15 minuti.
- Rimuovere il surnatante dagli EB e aggiungere i mezzi di differenziazione MSC integrati con 10 μM RA.
- Risospendere delicatamente e distribuire 0,5 mL/pozzetto nella stessa piastra di attacco ultra-bassa a 24 pozzetti.
- Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 °C. Non disturbare gli EB per le successive 48 ore.
- Dopo 48 ore, raccogliere gli EB in una provetta da 15 ml e lasciarli riposare per 15 minuti.
- Rimuovere il surnatante dagli EB e aggiungere i mezzi di differenziazione MSC integrati con 0,1 μM RA.
- Risospendere delicatamente e distribuire 0,5 mL/pozzetto nella stessa piastra di attacco ultra-bassa a 24 pozzetti.
- Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 °C. Non disturbare gli EB per le successive 48 ore.
- Rimuovere l'RA aggiunto alle celle seguendo i passaggi descritti di seguito.
- Dopo 48 ore dell'ultimo trattamento RA, raccogliere gli EB e lasciarli riposare per 15 minuti.
- Rimuovere il surnatante e aggiungere DMEM a basso contenuto di glucosio senza citochine.
- Risospendere delicatamente e distribuire 0,5 ml/pozzetto in una piastra di fissaggio ultrabassa da 24 pozzetti. Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 °C.
- Placcare gli EB derivati da iPSC seguendo i passaggi descritti di seguito.
- Dopo 48 ore dal passaggio precedente (punto 2.4), raccogliere gli EB in una provetta da 15 ml e lasciarli riposare per 15 minuti.
- Rimuovere il surnatante e risospendere in 2 mL di nuovo terreno di differenziazione MSC.
- Trasferimento in due pozzetti di una piastra a 6 pozzetti rivestita con matrice di membrana basale.
- Cambia il supporto a giorni alterni per altri 5 giorni.
- Dopo 5 giorni, rimuovere il terreno esaurito e sostituirlo con nuovi terreni di differenziazione MSC contenenti 2,5 ng/ml di fattore di crescita basico dei fibroblasti (bFGF).
- Passare gli EB placcati quando raggiungono l'80% -90% di confluenza, seguendo i passaggi descritti di seguito.
- Lavare le cellule con DPBS, aggiungere tripsina-EDTA-500 μL per un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e incubare le cellule a 37 °C per 3 minuti.
- Raccogliere le cellule utilizzando il mezzo di differenziazione MSC in un tubo conico da 15 mL e ruotare a 750 x g per 4 minuti.
- Risospendere nei mezzi di differenziazione MSC con 2,5 ng/mL di bFGF e placcare le celle su piastre rivestite con matrice di membrana basale con un rapporto di 1:3.
- Ripeti il passaggio quando le celle raggiungono il 70% -80% di confluenza. Si prevede di guadagnare 3-6 milioni di cellule da 2-3 passaggi.
3. Analisi citometrica a flusso di MSC derivate da iPSCs
NOTA: Dopo aver subito 2-3 passaggi, è necessario accedere alle celle per l'efficienza della differenziazione MSC. La differenziazione sarà considerata di successo se le cellule esprimono marcatori di differenziazione MSC - CD44, CD73, CD90 e CD105 con un'efficienza superiore al 90% e non esprimono alti livelli di marcatori ematopoietici - CD14, CD19, CD34 e CD45. È possibile accedere all'efficienza di questi marcatori seguendo i passaggi seguenti.
- Far passare le celle utilizzando i passaggi descritti sopra (passo 2.6) e ottenere 1 x 105 celle in un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti con fondo a V.
- Centrifugare la piastra a 375 x g per 4 minuti a 4 °C.
- Risospendere 1 x 105 cellule in 100 μL di DPBS freddo con 1 μL di anticorpo coniugato (Ab) (vedere Tabella dei materiali) e incubare a 4 °C per 30-40 minuti evitando l'esposizione alla luce.
- Risospendere altre 1 x 105 cellule in 100 μL di DPBS freddo con il rispettivo controllo isotipo dell'Ab coniugato ad una concentrazione di 1:100 ) e incubare a 4 °C per 30-40 minuti evitando l'esposizione alla luce.
- Dopo l'incubazione, centrifugare la piastra a 375 x g per 4 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante scuotendo la piastra sopra il lavandino.
- Risospendere le cellule in 100 μL di DPBS freddo.
- Centrifugare le celle a 375 x g per 4 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante.
- Risospendere le cellule in 200 μL di DPBS freddo e raccogliere in provette di microcentrifuga da 1,5 mL buie e fredde e tenerle sul ghiaccio fino a quando non vengono analizzate mediante selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS).
- Per l'analisi FACS, distribuire le celle utilizzando il lato sparso (SSC-A) rispetto al diffuso in avanti (FSC-A) per escludere i detriti. Inoltre, distribuire le cellule gated utilizzando l'altezza diffusa in avanti (FSC-H) rispetto all'area diffusa in avanti (FSC-A) per distinguere i singoletti dai doppietti dalla popolazione di cellule vive.
NOTA: Le celle sono state controllate rispetto allo spostamento del controllo isotipo per ogni marcatore e per l'analisi è stato utilizzato un minimo di 10.000 eventi controllati da ogni campione colorato.
4. Differenziazione delle MSC in adipociti
- Preparare i terreni basali di differenziazione degli adipociti aggiungendo il 10% di siero sostitutivo knockout (KOSR), l'1% di glutammina, l'1% di P/S, 4,5 ng/μL di glucosio al minimo di media essenziali (MEM)-alfa e conservare a 4 °C.
- Consentire alle MSC di raggiungere una confluenza superiore al 90%. Continuare a coltivarli per altre 48 ore per consentire loro di subire un periodo di arresto della crescita.
- Preparare mezzi completi di differenziazione degli adipociti aggiungendo 100 μg/mL di 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX), 1 μM di desametasone, 0,2 U/ml di insulina, 100 μM di indometacina e 10 μM di rosiglitazone ai terreni basali.
- Rimuovere i mezzi di differenziazione MSC e lavare le celle utilizzando DPBS.
- Aggiungere un mezzo completo di differenziazione degli adipociti - 2 ml per un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e 1 ml per un pozzetto di una piastra a 12 pozzetti - e incubare le cellule a 37 °C. Cambiare i mezzi di differenziazione completi a giorni alterni per 14 giorni.
5. Valutazione dell'efficienza differenziativa degli adipociti
- Il giorno 14 della differenziazione, controllare l'efficienza della differenziazione mediante colorazione delle cellule per i marcatori di maturazione degli adipociti, FABP4 e adiponectina.
- Rimuovere il supporto e lavare le celle con DPBS.
- Fissare le cellule usando il 4% di paraformaldeide (PFA) - 200 μL in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti - e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti.
- Scartare il PFA e lavare con soluzione salina tris-buffered con interpolazione allo 0,5% (TBST) e posizionarlo su uno shaker a temperatura ambiente per 15 minuti. Ripeti il processo due volte.
- Permeabilizzare le celle fisse con soluzione salina tamponata fosfato allo 0,5% Triton X-100 (PBST) e posizionarlo su uno shaker a temperatura ambiente per 15-20 minuti.
- Scartare il PBST e aggiungere il tampone bloccante (5%-6% albumina sierica bovina (BSA) in PBST)-500 μL per un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e 250 μL per un pozzetto di una piastra da 12 pozzetti - e incubare a temperatura ambiente sullo shaker per 40-60 minuti.
- Diluire gli anticorpi primari contro FABP4, adiponectina in 2%-3% BSA, ad una concentrazione di 1:500 (vedere Tabella dei materiali). Sommare questi anticorpi solo se allevati in animali diversi e posizionare la piastra sull'agitatore a 4 °C, durante la notte.
- Rimuovere gli anticorpi primari e lavare le cellule tre volte con TBST (15 minuti ciascuna) e posizionarlo su uno shaker a temperatura ambiente.
- Preparare gli anticorpi secondari Alexa Fluor in PBST (1:500). Incubare le cellule nelle combinazioni di anticorpi secondari (secondo la specie in cui viene sollevato l'anticorpo primario) per 60 minuti a temperatura ambiente e coprire la piastra con un foglio di alluminio per proteggerla dalla luce.
- Scartare gli anticorpi secondari, lavare con TBST tre volte e posizionare la piastra sullo shaker.
- Per colorare i nuclei, aggiungere 1 μg/mL di Hoechst 33342-200 μL per un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti diluita in PBS e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Scartare la soluzione di Hoechst e aggiungere PBS-500 μL per un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti alle cellule. Tenere le lastre coperte dalla luce fino a quando non vengono visualizzate utilizzando un microscopio a fluorescenza invertita.
6. Ordinamento degli adipociti con il rosso del Nilo
- Preparare la soluzione di lavoro rosso del Nilo aggiungendo 1 mg/mL di brodo rosso del Nilo in DMSO e conservare a -20 °C. Subito prima dell'uso, scongelare il brodo rosso del Nilo e ricostituire in DPBS per raggiungere una concentrazione della soluzione di lavoro di 300 nM.
- Durante o dopo il giorno 14 della differenziazione degli adipociti, eliminare il terreno dalle cellule e lavare utilizzando DPBS.
- Aggiungere la soluzione di lavoro rosso del Nilo -1 mL in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti- e incubare a 37 °C per 15 minuti.
- Rimuovere la soluzione di rosso del Nilo e aggiungere tripsina-EDTA -500 μL in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e incubare a 37 °C per 4 minuti.
- Raccogliere le cellule utilizzando DMEM contenente il 5% di FBS in un tubo conico da 15 ml. Centrifugare a 750 x g per 4 min.
- Rimuovere il surnatante e risospendere in DPBS-1 mL per 1 x 106 cellule. Centrifugare a 750 x g per 4 min.
- Rimuovere il surnatante e risospendere in DPBS-1 mL per 1 x 106 cellule. Utilizzare uno smistatore FACS per isolare i globuli rossi positivi del Nilo utilizzando il canale FL1.
- Ri-coltura delle cellule selezionate in mezzi di differenziazione degli adipociti o raccogliere le cellule selezionate per l'isolamento di RNA e proteine.
- Estrarre l'RNA dalle cellule selezionate ed eseguire analisi quantitative relative dei marcatori di differenziazione degli adipociti, tra cui FABP4, PPARG e C / EBPA. I globuli rossi del Nilo mostrano una significativa sovraregolazione nell'espressione genica di almeno due volte rispetto alle cellule non selezionate.
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Representative Results
Schema e morfologia delle cellule durante il differenziamento mesenchimale: La differenziazione delle iPSC in MSC coinvolge varie fasi di sviluppo che vanno dalla formazione di EB, alla differenziazione delle MSC e all'espansione delle MSC (Figura 1). Durante queste fasi di sviluppo, le cellule acquisiscono morfologia diversa a causa delle diverse sostanze chimiche stimolatorie a cui sono sottoposte. All'inizio della differenziazione, le celle sono placcate in sospensione e ci si aspetta che siano rotonde, con bordi cellulari definiti, pur essendo di piccole e medie dimensioni di diametro (Figura 2). La scelta di coltivare cellule in sospensione durante la fase iniziale del differenziamento consente di assomigliare molto al processo di sviluppo embrionale naturale, rendendo questa fase altamente cruciale per il successo della differenziazione. La fase di formazione dell'EB e del trattamento dell'AR è seguita dalla placcatura degli EB su piastre rivestite con matrice di membrana basale. La vitalità degli EB al momento della placcatura può essere accessibile osservando il loro comportamento di rapida proliferazione che dà origine a più MSC (Figura 2). Questo rapido comportamento di proliferazione mostrato dalle MSC viene mantenuto anche dopo averle passate su piastre rivestite di matrice fresca insieme a mantenere una morfologia peculiare e allungata (Figura 2).
Valutazione quantitativa dei marcatori di superficie MSC: l'efficienza di differenziazione delle MSC è accessibile mediante quantificazione dei marcatori di superficie specifici per la differenziazione MSC. Una buona differenziazione che produca MSC affidabili dovrebbe mostrare un'efficienza superiore al 90% dei marcatori di superficie mesenchimali CD73, CD44 e CD90 (Figura 3A). Oltre a ciò, le cellule sono anche valutate per l'assenza di marcatori di superficie raffiguranti fenotipo ematopoietico, CD14, CD34 e CD19, e quindi si prevede che mostrino un'efficienza di espressione inferiore all'1% per loro (Figura 3B).
Differenziazione delle MSC in adipociti: è possibile accedere alla differenziazione delle MSC in adipociti mediante colorazione per FABP4 e adiponectina. FABP4 è una proteina citoplasmatica ed è considerata un marker per gli adipociti terminalmente differenziati. La sua elevata espressione tra gli adipociti, con una distribuzione citoplasmatica, è un segno chiave della loro maturità evolutiva (Figura 4A). Oltre a FABP4, l'adiponectina è considerata uno dei marcatori importanti per la maturità degli adipociti. La sua alta espressione indica che gli adipociti sono abbastanza funzionali per subire l'accumulo lipidico e l'adipogenesi in risposta alla segnalazione del glucosio. Essendo una proteina secretoria, l'adiponectina presenta morfologia globulare con ogni globulo proteico facilmente distinguibile all'interno del citoplasma (Figura 4B).
Colorazione e selezione di adipociti maturi usando il rosso del Nilo: Al momento della differenziazione, gli adipociti maturi possono essere distinti dalle loro controparti immature dalla colorazione per il rosso del Nilo. Il rosso del Nilo si lega agli adipociti portatori di lipidi, una caratteristica esclusiva degli adipociti maturi (Figura 5A). Questo, insieme alla caratteristica del cuscinetto fluorescente del rosso del Nilo, lo rende uno strumento efficace per la selezione di adipociti maturi utilizzando la citometria a flusso attivato fluorescente (Figura 5B). Una selezione efficace dovrebbe comportare un miglioramento dei marcatori di maturazione - PPARG, C / EBPA e FABP4 - di almeno due volte, determinate mediante PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR) (Figura5C).
Figura 1: Diagramma schematico che mostra la differenziazione delle iPSC in MSC e adipociti. Le iPSC sono differenziate in MSC utilizzando la tecnica del corpo embrioide (EB). Gli EB sono sottoposti a una breve esposizione di 10 μM di acido retinoico all-trans (RA). Le MSC generate sono differenziate in adipociti 40%-77% in base alla linea iPSC. I globuli rossi positivi del Nilo vengono ordinati utilizzando FACS per ottenere una popolazione purificata di adipociti maturi che possono essere utilizzati per studiare i disturbi associati agli adipociti (modelli di malattia), identificare nuovi farmaci e, infine, per una terapia personalizzata. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Differenziazione delle iPSC in MSC. Immagini morfologiche rappresentative che mostrano diversi stadi di differenziazione MSC ai giorni 2 (D2), 11 (D11), 15 (D15) e 24 (D24). I corpi embrioidi (EB) generati in presenza di 10 μM di RA per 24 ore sono stati placcati al giorno 8 della differenziazione, seguiti da dissociazione e passaggio dopo 12-17 giorni di differenziazione. Le MSC sono state approvate più volte. Abbreviazioni: P2 = passaggio 2. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Espressione dei marcatori MSC e dei marcatori ematopoietici nelle MSC derivate da iPSC. Istogrammi rappresentativi di citometria a flusso che mostrano l'espressione dei marcatori MSC, CD73, CD44 e CD90, (A) e dei marcatori ematopoietici, CD34, CD19 e CD14 (B) nelle MSC generate da EB derivate da iPSC trattate con 10 μM di RA. L'asse X nel grafico rappresenta l'intensità fluorescente. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Differenziazione delle MSC derivate da iPSC in adipociti. Immagini immunocoloranti che mostrano l'espressione di FABP4 (A) e adiponectina (ADIPO) (B) in adipociti maturi derivati da iPSC. I nuclei erano colorati con Hoechst. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Ordinamento degli adipociti derivati da iPSC utilizzando il rosso del Nilo. (A) Immagini che mostrano il campo luminoso (BF) e gli adipociti maturi macchiati di rosso del Nilo. (B) Quantificazione del rosso del Nilo (cellule PE-positive) in adipociti maturi mediante FACS. (C) Analisi della PCR in tempo reale che mostra l'espressione di C/EBPA, FABP4 e PPARG in adipociti maturi ordinati rispetto a quelli non ordinati. I dati sono rappresentati come media ± DS; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo riveste un'importanza fondamentale grazie alla sua capacità di fornire MSC in termini di rendimento ed efficienza elevati. Questa produzione su larga scala di MSC è stata resa possibile dall'incubazione transitoria di EB derivate da iPSCs con 10 μM di RA14,15. Il trattamento transitorio con 10 μM di RA ha aumentato la resa MSC da 11,2 a 1542 volte14,15, con questo protocollo applicabile sia alle iPSC che alle hPSC. A questa dose e durata del trattamento, l'AR migliora le capacità proliferative e di sopravvivenza delle cellule che formano EB regolando direttamente o indirettamente l'espressione di diversi geni coinvolti nella proliferazione cellulare, nell'apoptosi e nelle aderenze cellula-cellula e cellula-ECM, che sono fondamentali per la sopravvivenza e la proliferazione delle iPSCs14,16. I geni includono, ma non sono limitati a, fattori di trascrizione (come EGFR4, SOX4), fattori di crescita e recettori dei fattori di crescita (come IGF2, FGFR4) e molecole di adesione (come FN1 e CAM). Tuttavia, a differenza delle basse dosi (0,1-10 μM), a dosi elevate (≥20 μM), l'AR regola negativamente la proliferazione e la sopravvivenza delle cellule che formano EB con conseguente riduzione del numero e delle dimensioni di EB derivate da PSC e quindi una diminuzione della resa di MSC14. L'AR è considerato un inibitore della proliferazione in diverse cellule normali differenziate e cancerose17,18,19. Negli EB, la segnalazione dei retinoidi dipende dal contesto (tempo, concentrazione, specie e linea cellulare); influenzare in modo differenziale l'auto-rinnovamento, la sopravvivenza e la differenziazione delle cellule che formano EB regolando geni distinti e vie di segnalazione20,21. Pertanto, l'uso di AR in un tempo ottimale e la concentrazione di RA-10 μM il giorno 3 dell'induzione EB seguita da una riduzione della dose a 0,1 μM il giorno 5 per 2 giorni, come descritto nel presente protocollo, è cruciale per indurre la sopravvivenza e la proliferazione delle cellule che formano EB.
Oltre a regolare la crescita e la sopravvivenza, l'AR sottopone gli EB trattati a ritardo di differenziazione rispetto alle cellule non trattate con RA14. Infatti, gli EB trattati con AR mantengono la loro forma compatta dopo la placcatura e non riescono a differenziarsi in cellule simili alle MSC, a differenza degli EB non trattati con RA. Ciò è coerente con studi precedenti che riportano che l'esposizione a breve termine al trattamento con AR inibisce la differenziazione cellulare attraverso la soppressione della segnalazione WNT21. Inoltre, queste cellule ritardate dalla differenziazione trattate con AR hanno anche mostrato una maggiore espressione della caderina e delle proteine della matrice extracellulare14, che sono note per svolgere un ruolo importante nel mantenimento dello stato pluripotente delle iPSCs16. Per rilasciare il blocco di differenziazione mediato da RA, gli EB devono essere dissociati, il che si traduce nell'interruzione delle aderenze cellulari e consente la differenziazione MSC a lungo termine durante la placcatura. È interessante notare che il trattamento con AR ha mantenuto un blocco di differenziazione sulle cellule, ma non ha mantenuto le cellule in uno stato pluripotente. Infatti, le cellule che formano EB sottoposte a esposizione a breve termine a 10 μM RA mostrano un'espressione significativamente ridotta dei marcatori chiave di pluripotenza: OCT4, SOX2 e NANOG14.
Le MSC generate dal trattamento a breve termine con AR delle EB hanno dimostrato di mantenere la loro tipica morfologia simile ai fibroblasti con abbondante espressione di marcatori di superficie MSC e la loro multipotenza dopo crioconservazione, rendendo così queste MSC prodotte in serie conservabili per studi di espansione a lungo termine14. Quando le sottopongono a condizioni di differenziazione adipogenica, condrogena e osteogenica, queste MSC potrebbero facilmente differenziarsi nei tre tipi di cellule mesodermiche, rendendole così una fonte facilmente raggiungibile per modellare le malattie correlate ai tessuti14. Pertanto, il comportamento in vitro stabile e versatile delle MSC generate dal protocollo di differenziazione mediato da RA fornisce loro un'importanza fondamentale nella ricerca e nelle impostazioni basate sull'applicazione.
Mentre i potenziali di differenziazione condrogenica e osteogenica delle MSC ottenute da EB trattate con AR sembrano essere simili a quelli delle MSC ottenute da EB non trattate, si è riscontrato che le prime mostrano un maggiore potenziale di differenziazione in linea adipogena quando sottoposte a condizioni di differenziazione adipogenica14. Ciò è stato evidenziato da un aumento da 2 a 3 volte dell'accumulo di lipidi intracellulari (colorazione Oil Red O) e delle cellule FABP4-positive del marcatore adipocitario nel pool di differenziazione delle cellule ottenute dopo aver coltivato le MSC derivate da EB trattate con AR con mezzi di differenziazione adipogenica, rispetto alle MSC derivate da EB non trattate con RA. Questa potrebbe essere la conseguenza della regolazione, da parte dell'AR, di diverse vie di segnalazione che regolano lo sviluppo degli adipociti come Hippo, WNT e le vie di interazione ECM-cellula, come rivelato dai dati di sequenziamento dell'RNA da EB trattati con AR e non trattati 14,22,23,24,25. Questa maggiore capacità delle MSC derivate da AR di sottoporsi a differenziazione adipogenica è preziosa, poiché i protocolli attualmente disponibili portano a una scarsa resa degli adipociti o fanno uso di manipolazioni genetiche che rendono gli adipociti generati inestimabili per derivare adipociti ricapitolati a processo naturale. Gli adipociti sono classificati in tre tipi: bianco, marrone e beige. Gli adipociti bianchi sono classificati in base alla presenza di una singola goccia lipidica e svolgono un ruolo nell'accumulo di energia. Mentre gli adipociti bruni sono coinvolti nel dispendio energetico dovuto all'ossidazione del substrato a causa dell'altissima abbondanza di mitocondri caratterizzata dall'espressione di UCP1. Mentre gli adipociti marroni che si trovano localizzati nel tessuto adiposo bianco sono noti come adipociti beige o marroni. Queste MSC hanno il potenziale per dare un'abbondante resa di adipociti bianchi data la pre-esposizione degli EB all'AR. Pubblicazioni precedenti hanno dichiarato l'induzione selettiva di iPSC in cellule che esprimono bassi livelli di UCP1, cioè adipociti bianchi, piuttosto che esporre cellule con alti livelli di UCP1 a RA26. Precedenti pubblicazioni hanno riportato che l'AR prodotta da cellule della cresta neurale in embrioni di topo e zebrafish svolge un ruolo importante nella formazione degli adipociti bianchi27,28.
Sebbene il protocollo basato su AR abbia permesso la generazione di MSC che forniscono una maggiore resa di adipociti che raggiungono il 48,5% -77,4% (rispetto al 22,5% -57,6% senza trattamento RA), non raggiungere il >90% è ancora problematico quando si modellano malattie genetiche multi-variante basate su adipociti in vitro. Infatti, non raggiungere una popolazione di adipociti puri potrebbe rendere ambivalenti i risultati provenienti da modelli di malattia multi-variante, in quanto sarebbe difficile distinguere se le differenze di sviluppo osservate sono dovute ai diversi corredi genetici o a causa di efficienze di differenziazione incoerenti. Per aggirare questo problema, era importante ordinare le cellule differenziate per ottenere un pool di adipociti maturi puri, in modo che eventuali differenze nei fenotipi potessero essere attribuite solo a differenze genetiche intrinseche. Diversi studi hanno identificato marcatori di superficie sugli adipociti che potrebbero potenzialmente essere utilizzati per la selezione. Ad esempio, il lavoro svolto da Ronald Kahn ha permesso l'identificazione del trasportatore di aminoacidi ASC-1 come nuovo marcatore di superficie sugli adipociti bianchi.29. Inoltre, gli studi che estraggono adipociti maturi dalle regioni omentali e sottocutanee hanno riportato che gli adipociti maturi esprimono CD34, CD36 e CD59 sulle loro superfici.30, in cui è stato segnalato che CD36 funziona come trasportatore di acidi grassi sulla superficie degli adipociti maturi31. Tuttavia, questi studi hanno fatto uso di popolazioni eterogenee di cellule derivate dal tessuto adiposo senza specificare l'espressione di questi marcatori solo alle popolazioni di adipociti maturi. Inoltre, questi marcatori possono essere espressi anche da altri tipi di cellule e non sono specifici per gli adipociti. Ad esempio, ASC-1 è presente sia sugli astrociti che sui neuroni.32, CD34 è un marker delle cellule staminali ematopoietiche33, CD36 è presente su piastrine, fagociti mononucleati, epatociti, miociti e alcuni epiteli33e CD59 è espresso sulle cellule endoteliali e linfoidi34,35. Pertanto, come soluzione alternativa, il rosso del Nilo, la colorazione fluorescente selettiva per i lipidi intracellulari, è stato utilizzato come possibile candidato per la selezione degli adipociti. Gli adipociti immagazzinano una quantità significativa di lipidi che possono essere rilasciati e utilizzati per produrre energia, costruire membrane o come molecole di segnalazione che regolano il metabolismo.36. Il colorante rosso del Nilo è stato precedentemente utilizzato nella citometria a flusso e nella microscopia per colorare gli adipociti derivati da MSC murine e umane37. Studi precedenti hanno riportato l'uso del rosso del Nilo per gli adipociti derivati da ESC e il potenziamento dei marcatori adipocitari dopo l'ordinamento38. Gli adipociti generati dalle MSC ottenuti con l'attuale protocollo basato su RA sono stati valutati per la loro capacità di essere colorati con il rosso del Nilo, indicando la loro maturità, e ordinati per purificarli. Queste cellule selezionate con il rosso del Nilo hanno mostrato un aumento da due a tre volte nell'espressione dei marcatori di maturazione degli adipociti, tra cui PPARG, C/EBPAe FABP4 rispetto alle cellule non selezionate, aumentando così ulteriormente la resa degli adipociti derivati da iPSCs. Sebbene questi marcatori siano espressi prima dell'accumulo lipidico, la loro espressione contrassegna una cellula per la differenziazione terminale in adipociti portatori di lipidi. Il controllo dell'efficienza di ordinamento da parte di questi marcatori ci consente di identificare un pool in cui tutte le celle sono espresse FABP4, CEBPae PPARg, che indica un pool, che era predestinato alla formazione di adipociti maturi. Le cellule sono ordinate in base al loro potenziale di colorazione al rosso del Nilo. L'efficienza di purificazione è aumentata di due o tre volte a causa dell'elevato numero di adipociti nella frazione non ordinata. Le dimensioni degli adipociti portatori di lipidi variano in gran parte durante la differenziazione, dove viene ordinato un pool di cellule con identica distribuzione dimensionale. La frazione non ordinata comprende adipociti portatori di lipidi, ma non sono completamente maturi e governati da proporzioni di dimensioni dissimili..
L'eterogeneità delle MSC isolate dal corpo umano è stata precedentemente riportata39. Questa eterogeneità dipende da diversi fattori, come l'origine MSC, i donatori e le condizioni39. Ciò può portare a variazioni nella loro efficienza nel trattamento di diverse malattie. Questo studio suggerisce che un breve trattamento con AR di hPSC prodotte in condizioni di coltura compatibili con le buone pratiche di fabbricazione (GMP) darebbe una popolazione omogenea di MSC. Ciò indica che l'attuale protocollo è un approccio promettente per generare un gran numero di MSC di grado clinico che possono essere utilizzate per la terapia basata su MSC.
La combinazione del protocollo di differenziazione MSC basato su RA che porta alla differenziazione degli adipociti e del protocollo di selezione rossa del Nilo ci ha permesso di ottenere adipociti derivati da iPSC con maggiore espressione di marcatori funzionali e maggiore resa e purezza. Pertanto, questo protocollo combinato consentirebbe la generazione, in quantità e purezza sufficienti, di adipociti maturi da individui geneticamente distinti e la potenziale scoperta di nuove varianti genetiche dietro i disturbi metabolici correlati agli adipociti.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione del Qatar National Research Fund (QNRF) (Grant No. NPRP10-1221-160041). Maryam Aghadi è stata sostenuta dalla borsa di studio GSRA del Qatar National Research Fund (QNRF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adiponectin | Abcam | ab22554 | Adipocyte maturation marker |
| anti-CD105 | BD Pharmingen | 560839 | MSC differentiation marker |
| anti-CD14 | BD Pharmingen | 561712 | MSC differentiation marker |
| anti-CD19 | BD Pharmingen | 555415 | MSC differentiation marker |
| anti-CD34 | BD Pharmingen | 555824 | MSC differentiation marker |
| anti-CD44 | abcam | ab93758 | MSC differentiation marker |
| anti-CD45 | BD Pharmingen | 560975 |
MSC differentiation marker |
| anti-CD73 | BD Pharmingen | 550256 | MSC differentiation marker |
| anti-CD90 | BD Pharmingen | 555596 | MSC differentiation marker |
| bFGF | R&D | 233-FP | MSC culture media supplement |
| C/EBPA | Abcam | ab40761 | Adipocyte maturation marker |
| Dexamethasone | Torics | 1126 | Adipocyte differentiation media supplement |
| FABP4 | Abcam | ab93945 | Adipocyte maturation marker |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 10082147 | MSC culture media supplement |
| Glutamax | ThermoFisher | 35050-061 | MSC culture media supplement |
| IBMX | Sigma Aldrich | I5879 | Adipocyte differentiation media supplement |
| Indomethacin | Sigma Aldrich | I7378 | Adipocyte differentiation media supplement |
| Insulin | Sigma Aldrich | 91077C | Adipocyte differentiation media supplement |
| Knockout DMEM | ThermoFisher | 12660012 | Basal media for preparing matrigel |
| Low glucose DMEM | ThermoFisher | 11885084 | MSC culturing media |
| Matrigel | Corning | 354230 | Coating matrix |
| MEM-alpha | ThermoFisher | 12561056 | Adipocyte differentiation media |
| Nilered | Sigma Aldrich | 19123 | Sorting marker for adipocyte |
| Penicillin | ThermoFisher | 15140122 | MSC/Adipocyte media supplement |
| Phosphate-buffered saline | ThermoFisher | 14190144 | wash buffer |
| Pierce™ 20X TBS Buffer | Thermo Fisher | 28358 | wash buffer |
| PPARG | Cell Signaling Technology | 2443 | Adipocyte maturation marker |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | Dissociation reagent |
| Retinoic acid | Sigma Aldrich | R2625 | MSC differentiation media supplement |
| Rock inhibitor | Tocris | 1254/10 | hPSC culture media supplement |
| Roziglitazone | Sigma Aldrich | R2408 | Adipocyte differentiation media supplement |
| StemFlex | ThermoFisher | A334901 | hPSC culture media |
| Triton | Thermo Fisher | 28314 | Permebealization reagent |
| Trypsin | ThermoFisher | 25200072 | Dissociation reagent |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P7942 | Wash buffer |
References
- Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Communication and Signaling: CCS. 9, 12 (2011).
- Wagner, W., et al. Aging and replicative senescence have related effects on human stem and progenitor cells. PLoS One. 4 (6), 5846 (2009).
- Brown, P. T., Squire, M. W., Li, W. J. Characterization and evaluation of mesenchymal stem cells derived from human embryonic stem cells and bone marrow. Cell and Tissue Research. 358 (1), 149-164 (2014).
- Trivedi, P., Hematti, P. Derivation and immunological characterization of mesenchymal stromal cells from human embryonic stem cells. Experimental Hematology. 36 (3), 350-359 (2008).
- Barberi, T., Willis, L. M., Socci, N. D., Studer, L. Derivation of multipotent mesenchymal precursors from human embryonic stem cells. PLoS Medicine. 2 (6), 161 (2005).
- Xiong, C., et al. Derivation of adipocytes from human embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 14 (6), 671-675 (2005).
- Cuaranta-Monroy, I., et al. Highly efficient differentiation of embryonic stem cells into adipocytes by ascorbic acid. Stem Cell Research. 13 (1), 88-97 (2014).
- van Harmelen, V., et al. Differential lipolytic regulation in human embryonic stem cell-derived adipocytes. Obesity (Silver Spring). 15 (4), 846-852 (2007).
- Noguchi, M., et al. In vitro characterization and engraftment of adipocytes derived from human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 22 (21), 2895-2905 (2013).
- Ahfeldt, T., et al. Programming human pluripotent stem cells into white and brown adipocytes. Nature Cell Biology. 14 (2), 209-219 (2012).
- Lee, Y. K., Cowan, C. A. Differentiation of white and brown adipocytes from human pluripotent stem cells. Methods in Enzymology. 538, 35-47 (2014).
- Abdelalim, E. M. Modeling different types of diabetes using human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (6), 2459-2483 (2021).
- Abdelalim, E. M., Bonnefond, A., Bennaceur-Griscelli, A., Froguel, P. Pluripotent stem cells as a potential tool for disease modelling and cell therapy in diabetes. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 327-337 (2014).
- Karam, M., Younis, I., Elareer, N. R., Nasser, S., Abdelalim, E. M. Scalable Generation of mesenchymal stem cells and adipocytes from human pluripotent stem cells. Cells. 9 (3), (2020).
- Karam, M., Abdelalim, E. M. Robust and highly efficient protocol for differentiation of human pluripotent stem cells into mesenchymal stem cells. Methods in Molecular Biology. , Clifton, N.J. (2020).
- Li, L., Bennett, S. A., Wang, L. Role of E-cadherin and other cell adhesion molecules in survival and differentiation of human pluripotent stem cells. Cell Adhesion & Migration. 6 (1), 59-70 (2012).
- Lai, L., Bohnsack, B. L., Niederreither, K., Hirschi, K. K. Retinoic acid regulates endothelial cell proliferation during vasculogenesis. Development. 130 (26), 6465-6474 (2003).
- Chanchevalap, S., Nandan, M. O., Merlin, D., Yang, V. W. All-trans retinoic acid inhibits proliferation of intestinal epithelial cells by inhibiting expression of the gene encoding Kruppel-like factor 5. FEBS Letters. 578 (1-2), 99-105 (2004).
- di Masi, A., et al. Retinoic acid receptors: from molecular mechanisms to cancer therapy. Molecular Aspects of Medicine. 41, 1 (2015).
- Simandi, Z., Balint, B. L., Poliska, S., Ruhl, R., Nagy, L. Activation of retinoic acid receptor signaling coordinates lineage commitment of spontaneously differentiating mouse embryonic stem cells in embryoid bodies. FEBS Letters. 584 (14), 3123-3130 (2010).
- De Angelis, M. T., Parrotta, E. I., Santamaria, G., Cuda, G. Short-term retinoic acid treatment sustains pluripotency and suppresses differentiation of human induced pluripotent stem cells. Cell Death & Disease. 9 (1), 6 (2018).
- Li, L., Dong, L., Wang, Y., Zhang, X., Yan, J. Lats1/2-mediated alteration of hippo signaling pathway regulates the fate of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. BioMed Research International. 2018, 4387932 (2018).
- Moldes, M., et al. Peroxisome-proliferator-activated receptor gamma suppresses Wnt/beta-catenin signalling during adipogenesis. The Biochemical Journal. 376, Pt 3 607-613 (2003).
- Ross, S. E., et al. Inhibition of adipogenesis by Wnt signaling. Science. 289 (5481), 950-953 (2000).
- Wang, Y. K., Chen, C. S. Cell adhesion and mechanical stimulation in the regulation of mesenchymal stem cell differentiation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (7), 823-832 (2013).
- Mohsen-Kanson, T., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells into brown and white adipocytes: role of Pax3. Stem Cells. 32 (6), 1459-1467 (2014).
- Billon, N., et al. The generation of adipocytes by the neural crest. Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).
- Li, N., Kelsh, R. N., Croucher, P., Roehl, H. H. Regulation of neural crest cell fate by the retinoic acid and Pparg signalling pathways. Development. 137 (3), 389-394 (2010).
- Ussar, S., et al. ASC-1, PAT2, and P2RX5 are cell surface markers for white, beige, and brown adipocytes. Science Translational Medicine. 6 (247), (2014).
- Festy, F., et al. Surface protein expression between human adipose tissue-derived stromal cells and mature adipocytes. Histochemistry and Cell Biology. 124 (2), 113-121 (2005).
- Cai, L., Wang, Z., Ji, A., Meyer, J. M., vander Westhuyzen, D. R. Scavenger receptor CD36 expression contributes to adipose tissue inflammation and cell death in diet-induced obesity. PLoS One. 7 (5), 36785 (2012).
- Mesuret, G., et al. A neuronal role of the Alanine-Serine-Cysteine-1 transporter (SLC7A10, Asc-1) for glycine inhibitory transmission and respiratory pattern. Scientific Reports. 8 (1), 8536 (2018).
- Silverstein, R. L., Febbraio, M. CD36, a scavenger receptor involved in immunity, metabolism, angiogenesis, and behavior. Science Signaling. 2 (72), (2009).
- Brooimans, R. A., van Wieringen, P. A., van Es, L. A., Daha, M. R. Relative roles of decay-accelerating factor, membrane cofactor protein, and CD59 in the protection of human endothelial cells against complement-mediated lysis. European Journal of Immunology. 22 (12), 3135-3140 (1992).
- Davies, A., et al. CD59, an LY-6-like protein expressed in human lymphoid cells, regulates the action of the complement membrane attack complex on homologous cells. The Journal of Experimental Medicine. 170 (3), 637-654 (1989).
- Lapid, K., Graff, J. M.
- Aldridge, A., et al. Assay validation for the assessment of adipogenesis of multipotential stromal cells--a direct comparison of four different methods. Cytotherapy. 15 (1), 89-101 (2013).
- Schaedlich, K., Knelangen, J. M., Navarrete Santos, A., Fischer, B., Navarrete Santos, A. A simple method to sort ESC-derived adipocytes. Cytometry A. 77 (10), 990-995 (2010).
- Costa, L. A., et al. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells from natural niches to culture conditions: implications for further clinical uses. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (2), 447-467 (2021).
