Summary
我々は、蚊およびショウジョウバエにおける殺虫剤感受性を測定するための局所適用バイオアッセイの方法論および重要性を説明する。提示されたアッセイはハイスループットであり、昆虫の質量を利用し、したがって濃度の代わりに質量相対化された致死量の計算を可能にし、他の同様の方法よりも変動性が低い可能性が高い。
Abstract
公衆衛生および農業のための殺虫剤の継続的な使用は、広範な殺虫剤耐性および防除方法の妨げをもたらしている。蚊の個体群の殺虫剤耐性サーベイランスは、通常、疾病管理予防センター(CDC)のボトルバイオアッセイまたは世界保健機関(WHO)のチューブ検査を通じて行われます。しかしながら、これらの方法は、昆虫との可変殺虫剤接触、試験された比較的少数の生物、集団間の質量の広範な変動、および絶えず変化する環境条件のために、死亡率データに高度の変動をもたらし、変動する結果をもたらす可能性がある。この論文は、蚊とショウジョウバエの両方に対するハイスループット表現型バイオアッセイとして適応された局所適用バイオアッセイを提示し、殺虫剤濃度の範囲に沿って多数の昆虫を試験する。
このアッセイは、1)すべての生物との一貫した処理および殺虫剤接触を保証し、2)株と性別間の平均質量の違いを説明する非常に特異的な用量反応曲線を生成し(これは野外採取生物にとって特に重要である)、および3)統計的に厳密な中央値致死量(LD50)は、耐性比の比較に必要であり、幼虫駆除剤耐性サーベイランスにも使用される診断用量死亡率からの代替サーベイランスアプローチである。このアッセイは、蚊の集団を正確に表現型決定するための補完的なツールとなり、ショウジョウバエを使用して例示されるように、他の昆虫との使用に容易に適応可能である。我々は、このアッセイが、複数の昆虫種における遺伝子型と表現型殺虫剤耐性との間のギャップを埋めるのに役立つと主張する。
Introduction
蚊は、人間に伝染する病気のために毎年70万人以上の死亡の原因となっており、その半数以上がマラリアのみによるものです1。マラリアおよび他のベクター媒介性疾患の伝染に対する主な予防方法は、しばしば長持ちする殺虫剤ネットまたは屋内残留散布2の形態で殺虫剤を使用することである。しかし、殺虫剤耐性は、蚊および他の昆虫ベクター、ならびに農業害虫3,4の間で広まっている。レジスタンスを効果的に管理するためには、監視が非常に重要です5.そのためには、高精度で高スループットの抵抗検出方法が必要です。現在、蚊のための最も広範な殺虫剤耐性監視ツールは、WHOチューブ試験6およびCDCボトルバイオアッセイ7である。ショウジョウバエの場合、残留接触施用法(CDCボトルバイオアッセイに類似)は、一般的に使用される殺虫剤バイオアッセイ8、9、10である。しかしながら、これらの方法からのデータの変動性は典型的に高く、同じ実験室の蚊株の測定値は、CDCボトルアッセイで〜20〜70%、致死量以下の用量にさらされた場合のWHO管試験で0〜50%の範囲である11。このような変異は、ほとんどの実験室株における限られた遺伝的変異が、集団における限定的な殺虫剤感受性変動をもたらすと予想されるので驚くべきことである。それにもかかわらず、バイオアッセイ結果に観察された高レベルの変動が依然として存在する。
この変動の潜在的な原因は、表面を介した間接的な殺虫剤曝露、不均一な環境影響、同じ遺伝子型の個体間の正常な生物学的変動、および同じ集団の検体の質量の変動によるバイオアッセイ内の検体間の不均一な殺虫剤曝露の結果であり得る12.より高い再現性を有するあまり使用されない方法は、局所適用バイオアッセイである。このアッセイでは、殺虫剤を各昆虫13、14に直接塗布し、同じアッセイ内の異なる検体の不均一暴露の因子を除去する。しかし、この方法のスループットが遅いため、蚊の集団に対する殺虫剤感受性監視ツールとして日常的に使用されていません。この論文は、殺虫剤感受性の変化と相関するパラメータである昆虫塊の変動を補正しながら、よりスループットの高い曝露を可能にする局所適用バイオアッセイのための修正されたプロトコルを提示する12。可変殺虫剤曝露による死亡率データの騒音および質量関連変動の減少は、より正確な技術的耐性サーベイランスを可能にするであろう11,15。このようなデータは、表現型耐性を遺伝子マーカー、適応度パラメータ、および/またはベクター能力とより正確に関連付けるために使用することができる。さらに、このアッセイを他の昆虫種に容易に適応させることができることを実証するために、より小さな体の昆虫種であるショウジョウバエに対する局所適用バイオアッセイを使用する。
前述の残留接触用途の主な制限は、殺虫剤曝露が同じアッセイ内で検体ごとに異なる可能性があることである。CDCボトルバイオアッセイおよび接触法の場合、殺虫剤曝露は、同じアッセイの反復間で変化し得る。昆虫は、ガラス瓶の内側(CDCボトルバイオアッセイおよび接触法)または含浸紙(WHOチューブ試験)に分布する殺虫剤にさらされる。両面(ガラスおよび紙)における殺虫剤の濃度は、既知の遺伝子型の異なる種をスクリーニングすることによって既知であり、予め定められている。しかしながら、昆虫によって吸収される可能性があるために利用可能な量は、使用される表面、殺虫剤混合物成分、および殺虫剤が表面材料16、17にわたってどの程度均質に分布しているかによって大きく異なり得る。CDCボトルバイオアッセイでは、ボトルの内側の殺虫剤コーティングは、各実験室およびユーザーが採用する手順に依存する。WHOのチューブテストでは、殺虫剤処理された紙は集中的に生産されるため、ラボ全体で非常に均質である可能性が最も高いです。しかし、WHOチューブ試験では、暴露チューブは検体が非殺虫剤暴露金属メッシュ上に着陸して休むことを可能にし、各試験内の検体間で潜在的に不均一な殺虫剤曝露をもたらす。各方法で検体に拾い上げられ吸収された殺虫剤の実際の量は、まださらに調査する必要があります18.
さらに、CDCボトルバイオアッセイ、WHOチューブ試験、および接触法は、1つの所定の殺虫剤濃度のみを試験する閾値アッセイとして最も一般的に使用される。このアプローチは、抵抗の存在を正確に検出することができ、抵抗監視(特に抵抗が広がっている場合)にとって有益です。しかし、閾値アッセイでは耐性の強さを定量化できず、介入ツールの有効性をより予測できる可能性があります。これらの方法で複数の殺虫剤濃度を使用する場合、それらは強度アッセイとして使用することができる。CDCボトルバイオアッセイおよびWHOチューブ試験のための強度アッセイは、サーベイランス6、19におけるこのギャップに対処するために、所定の識別用量の5倍および10倍を試験することによって導入されている。耐性集団を区別するより大きな能力を提供する一方で、3〜5(予め決定された)投与量は、致死濃度を計算するための限られた分解能を提供する。さらに、様々なサイズの蚊がそのようなアッセイに使用される。しかし、単位質量当たりの有効線量はより小さな生物のそれよりもはるかに低いため、より大きな標本を殺すためにより高い線量を必要とする可能性があるため、質量を測定することは重要です12。質量相対化された致死量(昆虫質量あたりの殺虫剤の量)を計算することは、性別、集団、および遺伝子型間の昆虫質量の変動を考慮するため、より一般的な致死濃度(例えば、表面積あたりの殺虫剤の量)よりも有用な指標であろう。このようなデータは、実験室および現場における遺伝子型耐性と表現型耐性との間のギャップを埋めるのに役立ち、また、既知の平均質量の昆虫の集団を治療するために必要な適用濃度を計算する簡単な方法を提供する可能性がある。
検体の50%(LD 50)を殺す大量相対化致死量の使用には、他にもいくつかの利点があります。mg/kg(= ng/mg)単位の特定の化合物の毒性の評価は、ヒトおよび獣医の毒物学14において標準的であり、LD50 値は物質安全データシートに記載されています。致死的投与量はまた、特定の種に対する異なる化学物質間の毒性の直接比較、または異なる種20に対する同じ化学物質の毒性の直接比較、ならびに新規殺虫剤および化学物質13の高品質評価を可能にする。さらに、LD50 は、診断用量死亡率結果から導出されたものよりも有意義で正確な耐性比を提供することができ、これは集団中に存在する耐性レベルの過大評価をもたらし得る。したがって、このアッセイは、他のバイオアッセイに推奨されるよりも多くの検体に由来する大量相対化致死量に基づくより厳密な耐性モニタリングを提供することにより、日常的なサーベイランスプログラムに適しているであろう21。
局所適用方法は、耐性がすでに既知または疑われる場合の標準的な殺虫剤感受性バイオアッセイの代替として、蚊およびハエの殺虫剤感受性サーベイランスにおいて使用されてきた22,23、ならびに耐性プロファイルおよび殺虫剤固有毒性をより正確に評価するためのいくつかの害虫昆虫24におけるサーベイランス21.局所適用バイオアッセイでは、殺虫剤が各生物に適用され、殺虫剤曝露の変動が最小限に抑えられる。この論文は、殺虫剤曝露を短期間で多数の昆虫に適用し、昆虫塊22を防除することを可能にする、わずかに適応され改良された方法を提示する。良好なレベルの再現性を備えたこの高スループットの方法は、日常的な殺虫剤感受性監視のための有用な追加ツールとなり得る。
Protocol
注:殺虫剤は、人間、動物、および環境上の危険を引き起こす可能性があります25。注意、トレーニング、および個人用保護具を強くお勧めします。使用するすべての殺虫剤および溶媒の物質安全データシートに必ず従ってください。
1. 後部標本
- 後部3〜5日齢の成虫の蚊。
注:以下の議定書は、国連食糧農業機関のガイドライン26に厳密に従って、ヒトスジシマカの飼育条件を反映しています。- 27 ± 1 °Cおよび75 ± 5%の相対湿度で12:12時間の明暗サイクルですべてのライフステージの後部蚊。
- 蚊の卵を脱イオン水に浸して酵母26を加えて孵化させるか、水没した卵を真空チャンバー内に30分間置きます。
注:どちらの方法も、水中の酸素含有量を減少させ、ハッチング27を増加させる。 - 新しく孵化した幼虫の魚の餌(または挽いた猫のキブルなどの同等の食事)をトレイ内で給餌し、幼虫密度が発達12 に影響を与えるので、トレイ間で幼虫密度をできるだけ類似に保つ(例えば、合計1.5Lの水を含むトレイあたり200〜250匹の幼虫)。
- 幼虫が蛹期に達するまで1日おきに餌を与え(約7〜10日)、必要に応じて食物の量を増やします。
注:給餌が少なすぎると、幼虫の成長が妨げられ、幼虫は互いに食べることがあります。あまりにも多く給餌すると、幼虫が死に、水が汚れることがあります。 - 蛹が発達したら、成虫の蚊かごのウォーターボウルに毎日移し、10%のスクロース溶液を 自由摂取させます。
- 大人の出現の初日を記録します。出現開始後2日目にケージから残りの蛹を取り除く。
注:男性の蚊はより速く出現します。男性と女性の出現に注意し、各テストに十分な男性と女性が利用可能であることを確認してください。 - テストのために3〜5日齢の蚊を達成するために蛹を除去した後3日間待つ。
- 後部のフルーツハエ(チューリッヒ大学28のプロトコルに大まかに従っています)。
- 後部 ショウジョウバエ 株は、23 ± 1 °C、60 ± 5% の相対湿度でストックボトルに入れ、12:12 hの明暗サイクルで飼育しています。
注: ショウジョウバ エストックボトルには、最初に液体としてボトルの底に注がれ、その後一晩固化させる標準的なハエ培地75mLを含める必要があります。 - 2週間ごとに生鮮食品を入れた新しいストックボトルにコロニーを移し、人口過剰とカビの成長を防ぎます。これを行うには、ハンドヘルド二酸化炭素(CO2)ディスペンサーを使用してハエをノックダウンし、麻酔をかけたハエをアイスパックまたはチルテーブルの計量紙に移し、細かい先端のペイントブラシを使用してハエを新鮮なストックボトルにブラシをかけます。このプロセス中は、ハエが食べ物に落ちて溺れるのを防ぐために、ボトルを横に置いてください。
- 後部 ショウジョウバエ 株は、23 ± 1 °C、60 ± 5% の相対湿度でストックボトルに入れ、12:12 hの明暗サイクルで飼育しています。
2. 重量測定法を用いた殺虫剤製剤の調製
- ヒュームフード内で0.1mgの精度の分析スケールを使用して、重量測定アプローチに従って最初のストックソリューションを作成します。
注:重量測定アプローチは、添加された殺虫剤および溶媒の量を測定するために質量を使用する。標準的な慣行(容積測定アプローチ)では、最初の原液が調製されるときに添加される(固体)殺虫剤の量を測定するための分析スケールが必要となる。ただし、添加する溶媒の量およびそれに続くすべての希釈液は、体積によってのみ測定される。重量測定アプローチは、より高いレベルの精度を有するため、好ましい。- 最初の原液の目標殺虫剤濃度と目標体積(冷凍庫に保管するときにこぼれを防ぐために15mLの円錐管を使用する場合は最大10mLを推奨)を決定し、式(1)を使用して殺虫剤有効成分(AI)の量を計算します。
(1) - 保存チューブ(大容量の場合は15 mL円錐管、1 mL以下の容量には1.5 mLマイクロ遠心分離スクリューキャップチューブを推奨)を準備し、殺虫剤と溶媒名、目標濃度、および調製日でラベルを付けます。ラックまたはホルダー内のスケールにチューブと蓋を置き、スケールを風袋に入れます。
- ステップ2.1.1から決定した固体または液体殺虫剤AIの所望の量を秤量する。(例えば、代表的なデータに用いたデルタメトリンを)チューブに入れ、その質量を記録する。
- 目盛りを風袋に入れ、所望の体積の溶媒(目標体積に相当)をチューブに加え、すぐに蓋を閉め、質量を記録する。溶媒(ここではアセトンを使用)を加えた直後にチューブの蓋を閉め、蒸発を避け、溶液を混合してください。
- 室温を記録します。アセトンなどの一部の溶媒は、温度に応じて体積(および結果として密度)が大きく変化することがあります。
- すぐに保管する場合は、チューブの蓋をパラフィルムで包み(蒸発を減らすため)、チューブラック/ホルダーに入れ(直立して漏れを防ぐため)、ホイルで覆い(紫外線暴露を防ぐため)、再密封可能なビニール袋に入れ(蒸発を減らすため)、-20°Cの冷凍庫に入れてください。すぐに保管しない場合は、蓋が固定され、ホイルまたは軽く保護された容器で覆われていることを確認してください。
- 添加した殺虫剤AIの質量を溶媒添加量(液体の場合は殺虫剤添加量)で割って、原液の実際の濃度(mg/mL)を計算します。添加された溶媒(または液体殺虫剤)の体積を計算するには、添加された質量を、記録された温度に適した既知の密度で除算する。
- 添加した総質量(殺虫剤および溶媒)を添加された総体積(溶媒および殺虫剤、液体形態の場合)で割ることによって、原液の密度(g / mL)を計算する。液体の質量を体積に変換する手順 2.1.7 を参照してください。
- 最初の原液の目標殺虫剤濃度と目標体積(冷凍庫に保管するときにこぼれを防ぐために15mLの円錐管を使用する場合は最大10mLを推奨)を決定し、式(1)を使用して殺虫剤有効成分(AI)の量を計算します。
- 初期原液を10%希釈を介して連続希釈する。必要に応じて、これらの段階希釈を使用して初期用量反応曲線を作成し、バイオアッセイの殺虫剤濃度の標的範囲を特定します。
- 殺虫剤原液および溶媒の体積を計算し、各チューブに加える(例えば、以前の濃度の10%の10mL希釈のために9mLの溶媒で希釈した1mLの殺虫剤原液)。
- 原液を10秒間渦巻きます。スケール上に予めラベル付けされた第1希釈チューブを風袋にする。ピペットを用いて必要量の原液を第1希釈チューブに加える。直ちに両方のチューブの蓋を閉め、第1希釈チューブの質量を記録する。
- 最初の希釈チューブを再び風袋に入れ、必要な量の溶媒を加える。すぐに蓋を閉め、添加した溶媒の質量を記録し、最初の希釈液を10秒間渦巻きます。
- 残りの希釈液について、手順 2.2.2 と 2.2.3 を繰り返します。
- ステップ2.1.6で説明したように、すべての希釈液を保存します。
- 希釈液の実際の濃度は、ステップ2.1.7に従って計算します。
- 添加した全質量(殺虫剤溶液及び溶媒)を添加した全量(殺虫剤溶液及び溶媒)で除することにより、各殺虫剤希釈液の密度を算出する。各連続希釈について、以前の殺虫剤ストック希釈の密度を使用して、Eq(2)に従って新しい希釈液の密度を計算します。
(2)
- オプション: 殺虫剤希釈は、段階希釈によってより小さな増分で作成します。
- 最初の段階希釈、以前の試験、または出版された文献の用量反応曲線の助けを借りて作成する各新しい溶液の濃度および体積を選択する。
注:選択された濃度は、プロビット分析を可能にするために、この範囲から最低3つの濃度で0〜100%の死亡率範囲をもたらすべきである。 - 段階希釈液をストック溶液として使用して、新しい希釈液を作成し、ステップ2.2に従って10倍希釈液の間に新しい希釈液を作成します。
- 最初の段階希釈、以前の試験、または出版された文献の用量反応曲線の助けを借りて作成する各新しい溶液の濃度および体積を選択する。
- オプション:殺虫剤溶液をアリコートする。大量の殺虫剤溶液が作られた場合は、頻繁な取り扱いや光への暴露によるストック溶液の汚染、蒸発、劣化を避けるために、溶液を1.5mLスクリューキャップチューブにアリコートしてください。
- 溶液をアリコートし、最低濃度から始めて、潜在的な汚染を減らすために最高濃度に向かって作業します。開封前に10秒間ボルテックス処理して各原液を混合し、所望の容量(例えば、0.5mL)を予めラベル付けされたスクリューキャップチューブにピペッティングする。
- アリコートを耐光性容器に入れ、-20°Cの冷凍庫に保管してください。
注:アリコートをストック農薬希釈液から直接採取した小さな新しいアリコートと定期的に(毎月)交換することをお勧めします。これにより、サンプルがベンチで使用されている間、蒸発またはUV劣化による汚染が他の実験または変化に持ち越される可能性が制限されます。このプロトコルは、殺虫剤溶液が適切に保存され(ステップ2.1.6を参照)、-20°Cの冷凍庫に保管されている限り、ここで一時停止し、数年後にも再起動することができます。
- 永久マーカーペンを使用して、保存する前にメニスカスにマークを付け、溶媒蒸発を監視します。殺虫剤溶液を除去してアリコートを作るときは、溶液が除去されるたびにメニスカスにマークを付けます。
(1)
(2)3. 局所適用バイオアッセイワークスペースの準備
注:逃げる蚊やハエを簡単に捕獲するために、ベンチトップの昆虫処理テントで働くことをお勧めします。昆虫処理テントの画像については、 補足図S1 を参照してください。
- 必要な殺虫剤溶液を冷凍庫から取り出し、すぐに渦巻き、室温の耐光性容器に入れて殺虫剤を室温まで温めてから使用してください。
注:殺虫剤AIは、より涼しい温度で溶媒から分離することができます。さらに、アセトンは温度とともに変化し、適用される殺虫剤の用量を変化させる可能性がある。溶液を混合し、それらを室温に温めることは、殺虫剤溶液を使用する際の一貫性を確保するのに役立つ。 - 材料表で参照されているように、昆虫取り扱いテントでの局所適用アッセイに必要なすべてのツールと 材料を設定します。
- シリンジバレルと針を分析グレードのアセトンで洗浄し、アセトンアリコートあたり5回の洗浄を完了します。これを5つの別々のアリコートで完了し、合計25回の洗浄を行います。シリンジおよびリピータピペッタ部品については、 補足図S2 を参照してください。
- 5本の微量遠心チューブにそれぞれ0.5mLのアセトンを入れます。
- シリンジバレルに最初のチューブから0.025mLのアセトンを充填し、プランジャーを素早く押し下げてアセトンを廃容器に排出します。さらに4回繰り返して、同じアセトンアリコートから合計5回のアセトン洗浄を完了します。次に、シリンジバレルを空気で完全に満たし、空気と潜在的なアセトン残党を廃棄物容器に排出します。さらに2回繰り返して、空気で3回の「洗浄」を完了します。
- 残りの4本のアセトンチューブについて、手順3.3.2を繰り返します。
- シリンジプランジャーと針の上部の間にバレル内にエアポケットを作り、プランジャーをバレル内にわずかに引き上げます(〜5 mm)。
注:このエアポケットは、プランジャーが殺虫剤溶液に接触するのを防ぎ、殺虫剤の持ち越しを減らします。 - 局所適用に使用する準備ができるまで、シリンジを脇に置いておきます。
- 適用する線量を含むキーを作成し、乱数または文字ジェネレーターの後にランダム ID を割り当てます ( 補足ファイル 1 を参照)。
- プラスチック製の保持カップに、盲目的死亡率評価のためのランダムなIDのラベルを付けます。
メモ: 必要に応じて、プロトコルをここで一時停止し、後で再起動することができます。一時停止中に数時間以上経過した場合は、ステップ3.3を繰り返してシリンジが清潔であることを確認し、昆虫を投与する約1時間前まで殺虫剤溶液を冷凍庫に戻してから、ステップ3.1を繰り返すことをお勧めします。
4. 局所バイオアッセイ用の検体を調製する。手順の概要については、 図 1 を参照してください。
- 蚊を分類して計量する
- 吸入からの吸引によって駆動されるアスピレーターを使用して、損傷した個体を説明するための過剰を含む、アッセイに必要な3〜5日齢の成虫の蚊の所望の数を吸引する。蚊を円錐形のチューブ(チューブあたり最大100匹の蚊)に移すには、アスピレーターの先端を先端に巻き付けた綿でチューブに入れ、静かに息を吐き出してアスピレーターを叩く。アスピレーターの先端を取り外したら、綿を使用してチューブを差し込み、蓋でキャップします。一度にあまりにも多くの蚊でアスピレーターとチューブを満たすことは避けてください、これは蚊に追加のストレスを加えて死を引き起こす可能性があるからです。
- チューブ内の蚊を4°Cで最低10分間置くか、アイストレイの氷の下に埋めて、簡単にノックダウンします。
注:蚊は2°Cで数時間保持することができ、死亡率は最小限に抑えられます29。しかし、潜在的な悪影響を減らすために、蚊が氷の上にいる期間を最小限に抑えることが最善です。 - ノックダウンした蚊を昆虫処理テントに移し、氷の上に置かれたプラスチック製のトレイ(例えば、ペトリ皿)に慎重に蚊を傾ける。一度に約50匹の蚊だけを注いで、それぞれがその下の冷たいトレイに触れ、ノックダウンされたままであることを確認します。
- 蚊を鉗子で脚(または翼)で優しく拾い上げて性別で分類し、各性別を別々の保持カップに入れます。ソート中に各性別の蚊の数を数え、所望の数に達したら停止する。選別中に、怪我をしている(例えば、足が欠けている)か、特大(例えば、腹部が異常に拡大している)または小さい(肉眼で容易に区別できる)蚊は、その集団の平均蚊サイズよりも小さい)除去する。
注:付属器によって蚊を扱うことは、彼らの柔らかい一次体(例えば、腹部)への構造的損傷を減少させる。 - 0.1mgの精度で分析スケールを使用して、蚊の各カップの重量を記録します。
- ペトリ皿を蓋にした空のカップをスケールの上に置き、スケールを風袋に入れます。蚊を容器に注ぎ、蓋を上に置き、容器を体重計の上に置きます。
- 検体の重量と個数の合計をスコアシートに記録します( 補足ファイル2を参照)。すぐに標本のカップを氷の上に戻し、固定状態に保ちます。
- 試料のすべてのカップが計量されるまで、手順4.1.5.1-4.1.5.2を繰り返します。
- 準備した蚊を20〜25人のグループに分けて、ランダムなIDでラベル付けされた氷の上に置いた別々のカップに入れます。蚊を移すときは、鉗子によるストレスや物理的な損傷を軽減することを目指しています。理想的には、鉗子を使用して蚊を1〜2回だけ拾います:選別/計量に1回、実験カップに移すための潜在的な2回目。
注:カップあたりの理想的な蚊の数は20〜25であり、これは複製に十分であり、死亡率を評価するのに合理的であり、カップ内の密度誘発ストレス/死をもたらすべきではない。
- フルーツハエを分類して計量する
- CO2を使用してハエを7秒間麻酔する。
注:ハエがCO2 に7秒以上さらされている場合、30日目に目を覚ますと、クロールや飛行に問題が生じる可能性があります。 - ベンチペーパーで包まれたアイスパックにハエを注ぎ、先端の細かい絵筆を使って男性と女性を分離して数えます。
- ペイントブラシを使用して、選択したハエを優しく拾い上げ、清潔で空のストックボトルに入れます。雄と雌のショウジョウバエ(例:雄15匹、雌15匹)を同数選び、株名とショウジョウバエの合計(例:Canton-S、30匹のハエ)でストックボトルにラベルを付けます。
注:雄のショウジョウバエは、雌の存在から取り除かれた後、お互いに対する攻撃性が高まる可能性があるため、雌と雄のショウジョウバエを同数持つことが重要です31。したがって、非殺虫剤の死亡または傷害を避けるためには、雄と雌の数を同数にすることが最善である(または雄のショウジョウバエを完全に省略する)。 - 分析スケールを使用して、フルーツハエの各ボトルの重量を記録します。
- 空のバイアル(ランダムなIDでラベル付けされ、ステップ3.4を参照)を、ペトリ皿を蓋としてスケールの上に置き、スケールを風袋に入れます。
注:ガラスバイアルは、静電気を大幅に低減するため、フルーツハエでの使用をお勧めします。 - バイアルのランダムIDに対応するフルーツハエのボトルを、CO2 を使用して7秒間麻酔する。
- フルーツハエを計量紙に注ぎ、その紙を漏斗として使用してハエをバイアルに導入する。フルーツハエのバイアルの上にペトリ皿の蓋を置き、それをスケールの上に置きます。
- スコアシートに標本の合計重量と数を記録し、すぐにハエのバイアルを氷のトレイに置き、ハエが逃げるのを防ぐために蓋を上につけたままにします。
- フルーツハエのボトルごとに手順4.2.4.1-4.2.4.4を繰り返します。
- 空のバイアル(ランダムなIDでラベル付けされ、ステップ3.4を参照)を、ペトリ皿を蓋としてスケールの上に置き、スケールを風袋に入れます。
- CO2を使用してハエを7秒間麻酔する。
- 上記の手順が完了したら、すぐに次のセクションに進みます。
5. 線量標本
- シリンジに適切な殺虫剤濃度をロードする。最も濃縮されていない用量から始めて、生物の各グループで最も濃縮された用量に向かって作業します。無駄を防ぐために、必要な量の殺虫剤と推奨される余分な2μLをシリンジにロードするだけです。
- 氷の上のトレイの上に置いた計量紙の上に標本を傾けます。清潔で殺虫剤を含まないペイントブラシまたは綿棒を使用して、互いに近接している標本を分離して、投薬のために各検体に簡単にアクセスできるようにします。蚊の場合は、ペイントブラシを使用して、各標本が背甲に横たわっており、腹面が上を向いていることを確認してください。
- シリンジを使用して、殺虫剤溶液(または対照用のアセトン)の1滴を、蚊の場合は腹側胸部および腹部領域に、ショウジョウバエの場合は背部に塗布する。ショウジョウバエなどの小型の昆虫には0.2 μLの液滴(10 μLのシリンジが必要)、蚊には0.5 μLの液滴(25 μLの注射器が必要)を塗布します。
注:殺虫剤の感受性は、付属器(翼、脚、または吻部など)と比較して、主要な身体部分(頭部、胸郭、腹部など)間で有意に異ならない32。したがって、適用部位は、用量液滴が一次体に適用される限り、正確である必要はない。腹側胸部と腹部領域は、ノックダウンされたときに背側に横たわっていることが多いため、蚊に選ばれますが、背甲はノックダウンされたときに腹側に横たわっていることが多いため、フルーツハエに選択されます。このアプリケーションサイトの特異性の低下は、この方法のスループットの向上に役立ちます。 - 直ちに試料をラベルの付いたプラスチックカップに戻し、カップをネットとゴムバンドで覆います。カップを保持トレイに置き、このプロセスで殺された、損傷した、または逃げた標本をカップに書き留めます(そのカップ内の標本の最終的な数でそれらを除外するため)。最初のカップについては、投薬が完了した時刻を記録します。
- 投与間の殺虫剤汚染を避けるために、検体が置かれている計量紙を交換してください。
- すべての検体が適切な殺虫剤濃度で投与されるまで、各カップの投与を繰り返し、すべての検体が投与された終了時間を記録します。
- 浸した綿球を介して各カップに10%スクロース溶液を提供し、翌日に死亡率が評価されるまでカップを脇に置いておく。蚊を27±1°C、相対湿度 75±5%で保管し、フルーツハエは23±1°C、相対湿度60±5%で保存します。
メモ:綿球を絞るときは、過飽和や過飽和にならないように注意してください。綿球は湿っているはずですが、滴り落ちてはいけません。カップ内の砂糖水を滴下すると、検体の死亡率につながり、殺虫剤の死亡率評価に影響を与える可能性があります。
6. 死亡率を評価する
- 殺虫剤曝露開始後24時間で検体死亡率を記録する。蚊が飛んで直立することができれば、蚊を生きていると分類する。WHO6が記述しているように、彼らが動けない、または運動失調(飛行のために立ったり離陸したりすることができない)であれば、死んでいるように。ショウジョウバエ8,33について同じ死亡率評価に従ってください。
注:遅延死亡率を評価するために、死亡率は、毎日の砂糖水の変化で48および72時間後にさらに評価することができる。 - 死亡率が記録されたら、すべての検体のカップを冷凍庫の入った袋に入れて、廃棄またはその後の使用(分子分析または化学分析など)の前にすべての検体が死んでいることを確認してください。
7. 反復の実行
- 殺虫剤の感受性が1日34の時間に応じて変化する可能性があるため、毎日同じ時間に複製を実行するように注意しながら、新しい検体セットに対してステップ3〜6を繰り返します。
- 検体の50%を殺す致死量(LD 50)を正確に推定するために、各濃度に対して最低3回の反復を確保してください。高レベルの変動が観察される場合は、より多くの反復を含めます。
- すべてのデータが収集されたら、分析を完了します。
8. 結果を分析する
- スプレッドシート・プログラムにデータを記録し、ランダム ID キーを使用してデータのマスクを解除します (参照ステップ 3.4)。データをテキストファイル(補足ファイル3のデータ例を参照)として保存し、統計プログラムR35(補足ファイル4のRコード例を参照)または他の任意のソフトウェア36で分析する。
- ソフトウェア・プログラム内で、以下の分析を実行します。R コードの例については、 補足ファイル 4 を参照してください。
- 検体質量(mg)あたりの殺虫剤の投与量(ng)を以下の式(3)で計算する:
(3) - 死亡率を計算し、アボットの式37 を適用して、各対照37で観察された死亡率を基準に死亡率を補正する。あるいは、Schneider-Orelli (1947) の公式を使用して死亡率を補正する38.いずれの式を用いても、対照データが異常に高い場合を除き、前述の37 および実施39のように、各対照における死亡率に関係なく、すべてのデータに補正を適用する(下記の議論を参照のこと)。
注:アボットの公式およびシュナイダー・オレリの公式などの同等の代替案は、対照群で観察されなかった死亡率の程度に比例して死亡率値を調整し、死亡率が100%であったカップの死亡率の低下を引き起こさない。詳細については、これらの数式の引用文献を参照してください。 - 補正された死亡率データをプロビット(確率単位)値40 に変換し、殺虫剤用量と変換された死亡率データとの間で線形回帰を実行します。カイ二乗検定を使用して、線形モデルの適合度を評価します。
注: 0 (0% 死亡率) または 1 (100% 死亡率) の死亡率値は、プロビット変換を完了する前にデータから削除されます。これは、プロビット変換の性質上必要です。そのため、グラフ化されたデータには、陽性対照または陰性対照、または(アボットの補正が適用された後)0%または100%の死亡率をもたらしたその他のデータは含まれません。 - 以前に発表された方法39、41、42に従って、検体株、集団、および/または性別ごとのLD50および95%信頼区間(CI)を計算する。
- 注:2つの株の95%CIが重複しない場合、それらの株は有意に異なる用量応答を有する。
- 該当する場合は、対象のひずみのLD 50を参照/制御ひずみのLD50で割って抵抗比(RR)を計算します。
- 検体質量(mg)あたりの殺虫剤の投与量(ng)を以下の式(3)で計算する:
(3)
図1:局所適用アッセイプロトコル図。局所適用アッセイプロトコルは、(A)氷上で検体を選別することから始まり、続いて(B)分析スケールで標本を計量し、(C)殺虫剤溶液で検体を投薬し、(D)殺虫剤曝露後24時間の待機期間を(浸漬した綿球を介して)10%スクロース溶液に自由にアクセスし、続いて死亡率評価を行う。赤い矢印は、蚊(左)とショウジョウバエ(右)の殺虫剤散布目標位置を示す。画像は拡大縮小しないことに注意してください。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Representative Results
これらの代表的な結果は、 Ae. aegypti、Rockefeller(ROCK)、および既知のノックダウン耐性変異F1534CおよびV1016I(IICC遺伝子型)を有するフロリダからの単離された野外株の2つの異なる株を特徴とする。さらに、 ショウジョウバエメラノガスター (カントン:S株)が紹介されています。
図2および図3は、上記のプロトコールに従って試験された株および性別による各生物の用量応答を例示する。各系統内の雄蚊と雌蚊の線量反応曲線(ROCKではt=1.70、p = 0.098、IICCではt=0.64、p = 0.527)の間に差は認められなかったため、各蚊株内の男女のデータを共有した。ROCKおよびIICCの質量相対化LD50は、それぞれ0.008ng/mg(95%CI:0-0.104)および0.336ng/mg(95%CI:0.235-0.438)である。これらの値の95%CIは重複しておらず、株の用量応答が有意に異なることを示している。IICC株のRR(ROCK株に対する)は41.7であり、WHOによれば、これは高耐性であると考えられている5。広東-Sショウジョウバエの場合、質量相対化LD50は0.213ng/mg(95%CI:0-0.490)である。
図2:局所適用バイオアッセイを用いた蚊の代表的なデータ。デルタメトリンおよび蚊を用いた上記のプロトコールに続く局所適用バイオアッセイからの代表的な用量反応データ:(A)雌のAe. aegypti ROCK(n=880)およびIICC(n=550)株、(B)雄のAe. aegypti ROCK(n=880)およびIICC(n=569)株。デルタメトリン試験濃度は0.00075ng/μL~9.68705ng/μLの範囲であり、平均蚊の質量(mg)あたりに適用されるデルタメトリンの用量(ng)はx軸に反映される。死亡率は、Y 軸上の比率として表示されます。各データ ポイント クラスターを通る黒い線は、ひずみと性別固有の線形回帰を表します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:局所適用バイオアッセイを用いたショウジョウバエの代表的なデータ。 デルタメトリンおよびショウジョウバエを用いた上記のプロトコールに続く局所適用バイオアッセイからの代表的な用量反応データ: D. melanogaster Canton-S株(n=1014)。デルタメトリン試験濃度は0.00499〜5.02876ng / μLの範囲であり、平均ショウジョウバエ質量(mg)あたりに適用されるデルタメトリンの用量(ng)はx軸に反映される。死亡率は、Y 軸上の比率として表示されます。黒い線は線形回帰を表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足図S1:ベンチトップ型昆虫取扱テント。 ベンチトップ昆虫処理テントは、局所適用アッセイ中に逃げる蚊やハエの捕獲を容易にするために使用されます。構造は A で閉じ、 Bで開く。この構造は、PVCパイプと細かいメッシュの生地で建てられました。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S2:シリンジおよびリピータアプリケータユニット。 昆虫の投与に使用されるシリンジおよびリピーターアプリケーターユニット。主要部品は、1)針、2)シリンジバレル、3)プランジャー、4)リピーター、5)リピーターボタンを含む。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1:ランダム化スクリプト: 各実験のすべてのカップに対して偏りのないラベルを作成するランダム化スクリプト。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル2:死亡率スコアシート: 死亡率評価を支援するための死亡率スコアシート。シートはまた、殺虫剤施用の開始時刻および終了時刻などのプロトコルで参照されるように、記録する他のすべての重要な情報を記録する場所を含む。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル 3: 死亡率データの例:図 2 の作成に使用したデータ・ファイルの例。列見出しの説明は次のとおりです: "id" = 各データ ポイントの識別コード。「種」=種名(例えば、ヒトスジシマカ)。「殺虫剤」=局所的に適用される殺虫剤の名前(例えば、デルタメトリン);「株」=蚊の株の名前(例えば、ROCK);"date" = 開始日局所アプリケーション;「性別」=蚊の性別。「年齢」=蚊の年齢(若い= 3〜5日齢;年齢= 4週齢);"total.mosq" = バッチで計量された蚊の総数。「重量」=バッチ内のすべての蚊の重量(mg)。「濃度」=殺虫剤の濃度(μg/mL);「シリンジ」=シリンジの液滴容量(mL)。「用量」=各蚊に施用された殺虫剤有効成分の量(ng);「合計」=各カップ内の蚊の数。「死んだ」=各カップ内の死んだ蚊の数。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル4:R分析コード: Probit 分析を完了するために使用できる R コードの例 (プロトコルの手順 8 で説明)。代表的な結果 (補足サンプル データ ファイルからアクセス可能) は、この R コードで使用できます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
この論文は、蚊およびショウジョウバエの局所適用アッセイのための適合プロトコルを提示する。この手順は、最小限の特殊な機器を必要とするため、現場で他の生物と一緒に使用するように簡単に適応させることができます。以下に、このプロトコルの重要な手順、潜在的な変更、トラブルシューティングのアドバイス、方法の制限事項、およびこの方法の重要性を示します。
プロトコルの重要な手順: プロトコルには、誤って完了するとバイオアッセイの結果に劇的な影響を与える可能性のある3つの重要なステップがあります:殺虫剤濃度の精度、検体のノックダウン、および死亡率評価。
殺虫剤濃度精度:
反復可能な用量反応曲線と有意義な結果を得るためには、正確な殺虫剤溶液を持つことが非常に重要です。殺虫剤溶液調製への容積測定アプローチは、CDCボトルバイオアッセイ7および局所適用13、14、43の両方について文献内でより一般的である。しかしながら、ここで説明する重量測定アプローチは、(温度特異的な)密度を含めることによる温度の考慮のために本質的により正確であり、より正確な製剤調製につながる。
試料ノックダウン:
検体をノックダウンすることは、この方法の重要な要素であり、殺虫剤の正確な投与および重量測定を可能にする。しかし、生物を倒すことは、以前に実証したように、必然的に身体的ストレスと損傷のリスクを伴います30。したがって、試料をノックダウンする際には、i)各試料が同様の期間にわたってノックダウンされ、ii)ノックダウンの長さが最小限に抑えられ、iii)ノックダウンの方法がすべての試料にわたって一貫していることを確認するために、慎重かつ注意を払ってください。さらに、殺虫剤の施用前にノックダウン法を個別に試験して、方法が成功し、10%を超える制御死亡率を誘導しないことを確認することをお勧めします。経験の浅いユーザーにとっては、最初のテストに時間がかかることがあり、ノックダウン時間が長くなります。したがって、最初のアッセイの結果を解釈するときは注意してください。
死亡率評価:
死亡率を評価することは、特に殺虫剤が完全に殺すのではなく、蚊やハエを倒したり傷つけたりするだけの場合、困難な場合があります。したがって、殺虫剤が標的生物にどのように影響するかを認識し、開始する前に「死んだ」(またはノックダウンされた)生物の明確な定義を持つことが重要です。さらに、変動を減らすために、同じ人に用量と反復の間の死亡率を評価してもらうことをお勧めします。
プロトコルの変更: 以下に説明するいくつかの変形例をこのプロトコルに適用して、その汎用性およびアクセシビリティを改善することができる。
アッセイをより小型または大型の昆虫に適応させる:
より小さいまたはより大きな検体を使用する場合は、それぞれ殺虫剤のより少ないまたはより大きな用量量を適用することが推奨される。例として、0.5 μLの用量を0.2 μLの用量に減らすことによって、ショウジョウバエに蚊のプロトコルを適応させました。選択した用量量に対して正しいシリンジサイズが選択されていることを確認します。
野外昆虫へのアッセイの適応:
野外昆虫を使用する場合、昆虫の大きさにより多くのばらつきがあるかもしれません。したがって、昆虫を小さなグループ(例えば、カップあたり)で計量することは、大きなグループ(例えば、1つの実験に使用されるすべての昆虫)としてではなく、推奨されるであろう。これは、野外昆虫の質量の違いに関連する殺虫剤感受性の潜在的な変動を捉えるのに役立ちます。
機器の変更:
昆虫処理テント:検体の投与は、PVCパイプと蚊帳で簡単に構築された昆虫処理テントの下で完了することができます。これは、密閉された部屋(例えば、昆虫)の代替物であり得、昆虫飼育が起こる可能性のある地域での潜在的な殺虫剤汚染を排除するのに役立つ。この昆虫処理テントは建設が簡単で低コスト(〜$ 70)です。あるいは、昆虫処理ケージを購入することもできます(〜$ 425)。
チルテーブル:アイスパックまたは氷のトレイは、試料をノックダウンおよび/または試料をノックダウンしておくために使用することができる。
インキュベーター:インキュベーターは、検体を飼育し、殺虫剤処理後24時間検体を保持するために推奨されます。インキュベーターが利用できない場合は、構築することができます。インキュベーターを構築するために必要な機器には、断熱容器、加湿器、ヒートケーブル、湿度および温度コントローラ、およびライトが含まれ、これは以前の方法に従って拡張され、約$ 170の総費用に上るはずです44。
保持カップ:プラスチックカップは、処理された試料を分類して保持するために使用されますが、ワックスライニングされた紙コップまたはガラス容器が適切な代替品です。
生物およびライフステージの変更:
この方法は、他のベクター、昆虫、および/またはア カイエカキンケファシアトゥス 蚊32、イエバエ32、およびゴキブリ45などの節足動物、ならびに蚊の幼虫46などの非成虫の生活段階との使用に非常に適応可能である。
局所的なアプリケーションの場所の変更:
この方法は、殺虫剤を蚊の腹側胸部および腹部領域(およびショウジョウバエの背部)に適用することを記載する。ただし、他のアプリケーションの場所は、露出サイトが一貫している限り使用できます。殺虫剤感受性は施用場所32に基づいて変化し得るので、一貫性は重要である。
トラブルシューティングのアドバイス: この方法には、最初は困難ないくつかの手順があります。以下に、遭遇する可能性のある最も一般的な問題のいくつかを示します。
殺虫剤溶液の漏れ/蒸発:
殺虫剤は、一般に、揮発性の高い化合物であるアセトンに溶解される。これは、アセトンが室温で迅速に蒸発し、時間の経過とともに殺虫剤濃度を増加させることを意味する。殺虫剤溶液が漏れたり蒸発したりしているように見える場合は、溶液を作り直し、チューブの蓋がしっかりとオンになっていることを確認し、保存プロトコルが適切に守られていること(パラフィルムが使用されている、チューブが直立して保存されているなど)を再確認してください。漏れが続く場合は、アセトンが異なる温度で経験する体積の変化のためのより多くのスペースを可能にするために、より低い体積でチューブを充填してみてください。さらに、溶媒としてアセトンを使用する場合は、チューブがアセトン貯蔵用に定格されていることを確認してください(FEP、TFE、PFAプラスチックなど)。疎水性殺虫剤を使用する場合は、溶液をガラスバイアルに保管してください(疎水性殺虫剤がプラスチックよりもガラスに付着しないため)。蒸発を監視するために保存する前に溶液のメニスカスをマークすることも良い習慣です。
生物の体重を計量する際のマイクロバランス上の重量のドリフト:
体重計の重量測定値がドリフトしている場合(ゆっくりと上下している場合)、これは静的な状態が原因である可能性があります。ドリフトは、プラスチックが静電荷を容易に保持することができるので、プラスチックアイテムの生物を計量するときに最も頻繁に起こる。これを避けるために、計量されるプラスチック容器の下に計量紙を置くか、ガラスなどの非プラスチック容器を使用することができる。
異常な死亡率の結果:
死亡率の結果が異常に見える可能性がある多くの方法があり、例えば、対照における高い死亡率またはすべての殺虫剤用量にわたって高い/低い死亡率を観察する。各シナリオのトラブルシューティングについては、次のケースを確認してください。
高いコントロール死亡率
対照群で死亡率が高い(10%以上)場合は、ノックダウン法と検体がノックダウンされる時間の長さを評価します。可能であれば、標本がノックダウンされる時間を短くしてください。対照における高い死亡率について考慮すべき他の潜在的な要因には、i)インキュベーターの設定が正しいかどうかのチェックが含まれる - 異常な温度および/または湿度は死亡率の増加につながる可能性がある。温度と湿度は、独立したデータロガーで確認する必要があります。ii)昆虫の取り扱いを評価する。昆虫の扱いが多すぎたり、粗雑になりすぎたりすると、死亡率が高くなる可能性があります。iii)対照群または計装の治療に使用される100%アセトンに殺虫剤汚染がないかどうかを確認する。アセトンを交換し、すべての器具をアセトンまたはエタノールで洗浄してください。手袋を頻繁に交換し、こぼれを防ぎ、器具を清掃することで、汚染を避けてください。 補足ファイル3では、コントロール(アセトンのみ)カップ内で最大2匹の蚊が死亡したことに注意してください。この死亡率は高いとは見なされず(10%未満)、したがって、懸念の原因はなかった。
すべてのばく露群で死亡率が高い(ただし対照群ではそうではない)
試験には、より低い殺虫剤濃度またはより少ない用量量を使用してください。使用される投与量は、死亡率を誘発しない最小用量を超えている可能性があります。いくつかの10倍希釈を使用して正しい用量範囲を特定し、汚染を排除します。汚染を避けるために、最低濃度で投与を開始し、最高濃度に向かって作業してください。さらに、使用するすべての機器がアセトンおよび/またはエタノールで定期的に洗浄されていること、試料に適用される用量が非常に少なく、わずかな交差汚染でも結果に影響を与える可能性があることを確認してください。
すべての被ばく群における死亡率が低い
より高い殺虫剤濃度を使用してください。使用される投与量は、すべて集団の死亡率を引き起こすには低すぎる可能性があります。正しい用量範囲を特定するには、検体をさらに10倍の濃縮用量にさらします。殺虫剤溶液が期限切れまたは劣化していないことを確認してください(高温または光暴露による可能性があります)。ソリューションの有効期限が切れている場合、または劣化した疑いがある場合は、ソリューションを作り直し、適切なストレージ条件に従っていることを確認してください。
反復/日間の死亡率に一貫性がない
昆虫が殺虫剤に曝露される時刻は、特に代謝抵抗性34について発現される耐性のレベルに影響を及ぼす可能性がある。このプロトコルを毎日同じ時間帯に繰り返して、死亡率の変化に寄与する潜在的な変数としての時刻を回避します。反復間の一貫性のない死亡率に寄与する他の潜在的な要因には、i)実験間で差次的に飼育されている標本が含まれる。すべての検体が同じ年齢層で、同じ温度で、同様の密度と食物の入手可能性で飼育されていることを確認してください。ii)アセトン蒸発により経時的に分解またはより濃縮される殺虫剤濃度。ソリューションを再構築し、適切な保管条件を確認します。iii)一貫性のない死亡率スコアリング。同じ人が死亡率を得点することを確認するか、チーム全体で一貫して使用される明確なプロトコルを開発します。ブラインドスコアリングを使用して、死亡率スコアリングの偏りを減らします。
選別トレイの表面に付着している昆虫:
アセトンは、ペトリ皿などのこのプロトコルで使用されるプラスチックに反応します。ペトリ皿または同様のプラスチック表面にアセトンを使用すると、試料が表面に付着する可能性があります。この付着は、仕分けトレイに計量紙をライニングするか、非プラスチックの仕分けトレイを使用することで回避できます。さらに、選別トレイや保持カップ内のプラスチックの表面の結露は、結露に昆虫が付着したり、試料が寒すぎて表面に凍結する可能性があります。ノックダウン方式を調整して結露を低減し、試料が冷たくなったり凍りついたりするのを防ぎます(例:計量紙を試料とプラスチック選別トレイの間に配置します)。
R 分析エラー:
死亡率データが収集されると、分析中にさまざまな合併症が発生する可能性があります。R コードがデータ ファイルのアクションを完了できない最も一般的な理由は、データ形式がコードと一致しないことです (列見出しや空のセルなど)。より深刻な合併症が発生した場合は、Rstudio35に組み込まれているRヘルプページを参照してください。
上記の局所適用方法の制限:
局所適用法による殺虫剤吸収は、自然曝露を模倣しない:
一次体への局所適用は、殺虫剤吸収の自然な方法ではない。野外では、昆虫は、腹面上の急速な曝露ではなく、小さなエアロゾル粒子47、48を介して、殺虫剤処理された表面または翼に接触している時間にわたって、主に脚を通して殺虫剤を吸収する。しかし、既知の殺虫剤用量の直接適用は、遺伝的および進化的研究または空間または時間にわたる殺虫剤感受性の比較に必要な殺虫剤に対する表現型応答を正確に確立する。したがって、このアプローチは、技術的抵抗の試験には有益であるが、実用的な抵抗(フィールド設定15における実際の介入ツールの有効性)を直接測定するものではない。しかし、現在の標準的な方法(例えば、WHOチューブ試験およびCDCボトルバイオアッセイ)も、現場での殺虫剤曝露を(すなわち、曇らせることによって)捕捉または模倣することができないことに注意することが重要です。
局所適用アッセイは、接触吸収殺虫剤のみを評価することができる:
この方法は、殺虫剤の接触および吸収を介して作用する殺虫剤を対象としており、魅力的な毒性糖餌49において一般的に使用されるホウ酸などの経口殺虫剤と共に使用するためのものではない。
この方法の意義:
局所適用法は、致死量(濃度ではない)を計算し、技術的(実用的ではない)耐性を測定することによって、殺虫剤バイオアッセイのための十分に確立された標準を拡張する15。以下に、既存の殺虫剤感受性アッセイに対するこの方法の長所と短所を示します。
致死量計算:
この方法は、CDCおよびWHOバイオアッセイが判別用量11を確立するために使用する致死濃度ではなく、殺虫剤の致死用量を決定する。致死量は、死亡率を引き出すことが知られている殺虫剤の定量化された量であるため、より有意義である。対照的に、致死濃度は、生物が実際にどれだけの殺虫剤を獲得するかを考慮しない。致死量計算を使用すると、性別またはサイズ依存の感受性プロファイル間の差をより正確に観察および定量化できるため、この測定はさらに汎用性が高くなります。
技術的抵抗:
この方法は、標準化された制御された環境下で測定される抵抗である技術的抵抗を評価します。このような測定は、殺虫剤耐性の広がりの監視に適しており、表現型耐性を潜在的なマーカー15と結びつけるのに適している。局所適用バイオアッセイから生じる死亡率の変動が減少するため、新しい耐性マーカーのより優れた同定が可能になります。しかしながら、殺虫剤の蚊への不自然な曝露のために、このアッセイは、特定の集団における特定の介入の有効性の推定には適していない。このような実用的な抵抗の測定には他のアッセイが必要である15。
試料の適応性:
この方法は、作物害虫(例えば、コロラド・ポテト・ビートル)、ハウス・ペスト(例えば、ゴキブリおよびトコジラミ)、または花粉媒介者(例えば、ミツバチ)などの他の重要な節足動物に対して、ノックダウンアプローチおよび/または殺虫剤の用量、体積、および/または濃度(上述のように)を単純な変更で実施することができる。適応性の容易さは、異なる研究分野にわたる殺虫剤耐性研究を類推するのに役立ちます。検体の50%を殺す致死濃度(LC50 )の代わりにLD50値を使用することで、種間で正確な比較が可能になります。
費用：
CDCボトルバイオアッセイおよびWHOチューブ試験と同様に、局所適用アッセイを実行するためのコストは最小限に抑えられます( 材料表を参照)。重要な機器は、シリンジ(約70ドル)とディスペンサー(約100ドル)で、アッセイ間で再利用可能です。
必要な試料の数:
局所適用アッセイカップごとに最低20〜25検体を使用する必要があります。実験ごとに最低5つの殺虫剤濃度を試験することが推奨され、手順には最低3回の反復が推奨される。全体として、これは、WHOチューブ試験またはCDCボトルバイオアッセイを使用して耐性強度試験を実行するために必要な検体の数に匹敵する、完全な試験に必要な最低300〜375検体をもたらす。しかし、局所適用バイオアッセイで変動性の低減が達成された場合、同じ数の検体が空間または時間にわたって感受性データを比較するためのより多くの統計的検出力につながる可能性があります。
Disclosures
著者らは利益相反がないと宣言しています。
Acknowledgments
この研究は、米国国立科学財団からSHへのCAREER賞(受賞番号2047572)によって支援されました。我々は、ショウジョウバエの飼育と局所適用アッセイの準備におけるダミアン・リベラの支援、ウィスコンシン大学マディソン校のガネツキー博士のカントンSショウジョウバエ株の共有、ロックフェラー株の共有のための疾病管理予防センター、IICCアイソリン株の共有のための米国農務省医療農業獣医昆虫学センターに感謝する。 図 1 は、 BioRender.com を使用して作成されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Thomas Scientific | 20A00L068 | Acetone aliquot storage |
| 1.5 mL screw cap tubes | Thomas Scientific | 1182K23 | Insecticide dilution storage |
| 15 mL conical tubes | VWR | 339651 | Insecticide dilution storage |
| 20 mL glass scintillation vials | Fisher Scientific | 0334125D | Fruit fly weighing |
| 25 μL syringe | Fisher Scientific | 14815288 | Topical applicator |
| Acetone | Fisher Scientific | AC423240040 | ACS 99.6%, 4 L |
| Aedes aegypti (IICC strain) | USDA CMAVE | NA | Insecticide resistant |
| Aedes aegypti (Rockefeller strain) | CDC | NA | Insecticide susceptible |
| Analytical scale | Fisher Scientific | 14-557-409 | Precision up to 0.1 mg |
| Aspirator | Amazon | 6.49986E+11 | Mosquito collection device |
| Bench paper | VWR | 89126-794 | Place under workspace |
| Cotton swabs | Amazon | B092S8JVQN | Use for sorting insects |
| Cotton wool balls | Amazon | B0769MKZWT | Use for sucrose solution |
| Dispenser | Fisher Scientific | 1482225 | Repeater pipettor |
| Drosophila melanogaster (Canton-S strain) | University of Wisconsin-Madison | NA | Insecticide susceptible |
| Fine-tipped paint brushes | Amazon | B07KT2X1BK | Use for sorting insects |
| Fruit fly stock bottles | Fisher Scientific | AS355 | Use for rearing and sorting fruit flies |
| Hand-held CO2 dispenser | Fisher Scientific | NC1710679 | Use for knocking down insects |
| Holding cups | Amazon | B08DXG7V1S | Clear plastic |
| Ice pack | Amazon | B08QDWMMW5 | Use for knocking down fruit flies |
| Ice trays | Amazon | 9301085269 | Use for knocking down insects |
| Insect forceps | Amazon | B07B4767WR | Insect forceps |
| Insecticide | Sigma-Aldrich Inc | 45423-250MG | Deltamethrin |
| Labeling stickers | Amazon | B07Q4X9GWX | 3/4" Color dot stickers |
| Labeling tape | Amazon | B00X6A1GYK | White tape |
| Netting | Amazon | B07F2PHHWV | Use for covering holding cups and insect handling tent |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712H371 | 100 mm x 15 mm |
| PVC Pipe | Lowe’s | 23971 | Insect handling tent materials |
| Rubber bands | Amazon | B00006IBRU | Use for securing mesh/net on cups |
| Sucrose | Amazon | B01J78INO0 | Granulated White Sugar |
| Weighing paper | VWR | 12578-165 | 4" x 4" |
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