Summary
本协议描述了一种从大鼠锁骨下静脉收集血液的简单有效的方法。无需麻醉即可快速、及时且易于识别的采样,并通过重复样本采集获得高质量的血液。
Abstract
大鼠广泛用于药代动力学(PK)和毒代动力学(TK)研究,这些研究需要在特定时间点收集一定量的血液以检测药物暴露。大鼠血液采样方法决定了血浆的质量,并进一步影响测试结果的精度。本协议中描述的锁骨下静脉采血方法在动物的意识状态下反复收集血液样本,以满足PK和TK测试的需要。约束处理的技巧和适当的针切口程序确保了采血的成功率。它易于操作,同时确保血浆的质量,同时满足动物福利。但是,这种方法需要熟练的操作,操作不当可能会导致动物虚弱,疼痛,跛行,甚至死亡。目前的方法已在测试设施中使用,对具有传统知识的Sprague Dawley(SD)大鼠进行为期4周的口服毒性研究。24小时内收集的最大血液量不超过动物总血液的20%。雄性和雌性动物的体重超过200克。数据显示,动物体重每周稳步增加,重复采集样本后临床观察结果正常。
Introduction
根据人用药品注册技术要求协调国际会议(ICH)指南1 和国家药品监督管理局(NMPA)指南2,毒代动力学(TK)研究中大鼠采血时间点的数量需要满足动态药物暴露评估的要求。大鼠的近似总血容量为55-70mL / kg体重3。采集时间点一般在给药后30 min内密集,之后减少,常规检测48 h内需采集100份以上血样4.例如,在口服药物的TK研究中,在12个时间点(0分钟,5分钟,10分钟,15分钟,30分钟,45分钟,1小时,2小时,3小时,4小时,8小时和12小时)收集血液样本。研究人员必须在大鼠中反复收集 200-250 μL 的血液,以获得用于 TK 测试的高质量血浆5.
大鼠采血部位包括尾血管、眶后丛静脉、下颌下静脉、心脏、腹主动脉6等。其中,从大鼠尾静脉采集血液是一种常用的方法,需要经验丰富且技术娴熟的操作人员7,8。从眶后丛静脉采集血液不太复杂;但是,不推荐使用此方法,因为它可能会损害大鼠的视力9,并且来自心脏和腹主动脉的血液仅适用于最终的血液采样10。另一种从有意识的大鼠下颌下静脉收集血液的方法已被证明会导致更多的并发症,并揭示血液样本质量不足11。因此,研究人员可能会对动物进行麻醉,以降低采样的难度。尽管如此,麻醉也增加了实验的成本,更严重的是,它会影响大鼠的代谢状态12。本协议使用一种快速直接的方法在大鼠锁骨下静脉中收集血液而无需麻醉,允许准确定位和双侧交替采血,以及时和重复的方式获得高质量的样品。
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Protocol
所描述的所有动物实验均由广东Lewwin药物研究所有限公司机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准,雄性和雌性Sprague Dawley(SD)大鼠,~6-11周用于实验。按照实验动物的护理和使用指南饲养大鼠13。
1. 动物制备
注意:本研究中使用的所有SD大鼠都是清醒的,没有被麻醉/安乐死。需要通过抓住动物背部的皮肤来约束处理的技巧。
- 找到大鼠颈部和前肢之间的锁骨下三角窝的最低点。向头部移动~2-3毫米,到达采血部位的针尖(图1)。使用电动剃须刀去除头发。
注意:根据实验需要,可能需要血清或血浆。本协议以血浆为例,不会影响采血的操作。 - 准备沾有75%酒精的棉签进行擦拭和消毒,并准备干燥的棉签进行擦拭。
2. 血液采样
注意:至少 2 人,都必须有采血和大鼠约束技术的经验,应执行以下步骤。
- 用一只手抓住颈部后部的皮肤,使大鼠的头部,颈部和乳房保持直立并暴露注射部位(视频1)。拉直注射部位一侧的前肢以保持其水平。
- 用另一只手保持注射器与大鼠头部平行,并将注射器向外倾斜5°-10°,使尖端向腹侧方向倾斜。
- 将针头完全插入前腔。拉回注射器以保持管内的负压。
- 慢慢地将针从深移动到浅,然后沿着相同的路径返回。当血液进入注射器针头时,固定针头的位置(视频2)。
注意:然后将血液以恒定的速率填充在注射器中,如图 2A (前视图)和 图2B (侧视图)所示。 - 根据该机构的动物护理和使用委员会制定的标准监测最大血量。这取决于动物的体重和健康状况。在没有其他要求的情况下,不要在24小时内去除超过动物总血量的20%,这需要~3周的恢复14。
- 收集足够的血液样本后,立即取出注射器并准备血液治疗(步骤3)。
- 对大鼠的注射部位加压~1-2分钟以止血。由于收集部位位于颈部下部,因此通过按压锁骨下静脉捏住皮肤以止血(图3)。
注意:当需要重复采血时,可以从双侧锁骨下静脉交替采集血液。 - 将老鼠放回笼子里,观察它的状况。
3. 处理血液样本
- 从注射器中取出针头并将其丢弃在锋利的工具容器中。将血液从注射器缓慢转移到 1.5 mL 管中。将注射器按在墙上以避免形成气泡(如果有)。
注意:由于压力可能导致红细胞破裂,请取下针头以防止溶血14. - 盖上微量离心管,轻轻轻弹,倒置至少五次,使血液与抗凝剂彻底混合。
- 收集血浆后120分钟内在室温下以2000× g 离心全血样品~10-15分钟。
- 使用移液器枪(参见 材料表)将上部血浆转移到空白微量离心管中。不要用下部全血触摸移液器头。处理或重新离心被红细胞污染的血浆。
- 立即使用样品或将其储存在-30°C。
注意:药物的特性决定了储存时间。从锁骨下静脉获得的血浆标本是半透明的,呈浅黄色。溶血可能使血浆变红。
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Representative Results
来自锁骨下静脉的良好血浆样品呈半透明的淡黄色(图4,左管)。不正确的血液采集或操作导致溶血(图4,右管)。
测试设施的数据显示,在对患有TK的SD大鼠滴眼液进行的为期4周的口服毒性研究中,在第一个(第1天)和最后一个给药日(第28天)之间的9个时间点(0小时,0.167小时,0.5小时,1小时,2小时,4小时,8小时,12小时和24小时)收集两次血液样本。TKB、TKC和TKD大鼠的剂量分别为10 mg/kg、30 mg/kg和100 mg/kg,剂量体积为10 mL/kg。第一次采样的采血量为~0.2mL,动物的年龄为~6-7周,雄性动物的体重为~268-297g,雌性的体重为~214-239g。最后一次采样的血容量为~0.3mL,动物的年龄为~10-11周,雄性动物的体重为~376-462g,雌性动物的体重为~254-300g。两次TK采血间隔28天。动物体重每周稳步增加,临床观察结果正常。250g大鼠的血液总量约为16mL15,24小时内收集的最大血液量不超过动物总血液的20%。雌性动物的体重数据见表 1,雄性动物的体重数据见 表2。
图1:采血部位针尖的描绘。 请点击此处查看此图的大图。
图2:血液提取过程。 血液顺利获得。(A) 前视图。(B) 侧视图。 请点击此处查看此图的大图。
图3:止血方法的表示。 请点击此处查看此图的大图。
图4:离心后的样品外观。 左管显示合格的等离子体图像。右管显示溶血样本。血浆呈粉红色或红色。颜色越深,溶血率越高。 请点击此处查看此图的大图。
图5:锁骨下静脉的解剖结构。 该静脉位于锁骨下方,针头刚穿过锁骨下三角窝不超过0.5厘米即可到达。它连接颈内静脉、椎静脉和颈外静脉形成颅静脉。 请点击此处查看此图的大图。
表1:雌性动物的体重数据。请按此下载此表格。
表2:雄性动物的体重数据。请按此下载此表格。
视频1:大鼠血液采样过程的自上而下视图。请点击此处下载此视频。
视频2:大鼠血液采样过程的侧视图。 请点击此处下载此视频。
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Discussion
从锁骨下静脉采集血液有一定的好处。(1)由于采血部位容易解离,并且由于大鼠的姿势不同,静脉丛不规则,因此所述方法可以在保持大鼠稳定舒适的姿势的同时,轻松定位静脉丛的位置。(2)操作简便,有利于技术人员技能的快速发展,对动物的痛苦少。(3)使动物舒适的操作模式大大减少了躁动行为并防止血液飞溅。(4)是一种高速(20 s)、高效率、低成本、无麻醉的抽血方法,从动物福利的角度降低了动物麻醉的风险和约束时间。
在该协议中,大鼠在约束过程中保持舒适,在处理时适度放松并避免长时间触摸。松散的处理使老鼠能够快速移动,并可能对动物或人造成意外伤害;相反,它可能导致大鼠缺氧。在按压采样部位时止血至关重要。操作员将动物抱在怀里,以便在黑暗中抚平它们。此外,采血时负压不能过高;否则,会导致血液采样不良。由于PK和TK研究需要反复采血,因此必须根据不同的动物体重和健康状况控制血容量;同时,替代采血点将有利于动物福利。如果动物体型小或虚弱,则在测试允许的条件下适当地为它们提供葡萄糖和其他补充剂。针头入口必须光滑无阻力,当没有血液可收集或没有阻力时,针头应以稍微调整的方向重新插入或改变侧面。在血液采样过程中,有必要避免混合从插入中取出两次的血液。当第一次注射的血样量不足时,需要第二次注射,需要更换注射器,并在溶血的情况下再次取替换管进行血液采集。建议一次完成采血。注射器中的血液附着在壁上并注入采血管中,以避免在此过程中产生气泡。为了及时采集血液,操作人员需要在采集前2分钟做好充分准备,并在采集前1分钟注射。当动物不太合作或操作困难时,必须提前安抚。因此,需要有一批合格的技术人员。
臂丛垂直于锁骨下静脉并位于锁骨下静脉后面,因此操作不当可能导致臂丛神经损伤、前肢疼痛、跛行、退缩和其他不良症状16.该技术也可以应用于豚鼠,满足豚鼠实验中的采血需求,但需要进一步研究通过这种方法从豚鼠身上抽血。
锁骨下静脉的解剖结构如图 5所示。锁骨下静脉位于锁骨下方,针头刚穿过锁骨下三角窝即可到达锁骨下静脉,不超过0.5厘米。因此,该方法存在风险,需要合格的专业人员。不合格的专业人员会导致动物多动、难以控制、血液循环不良、动物虚弱,甚至在连续采血后死亡。不正确的手术也会损害胸部或动脉。因此,让合格的专业人员参与以实现成功的实验至关重要。
总之,该协议提供了一种从大鼠锁骨下静脉收集血液的替代方法,为PK和TK研究提供了技术支持。
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Disclosures
王丽美、郭建民、钟晓曼、盛亚丽、赖启文、宋辉和杨伟在广东路温药物研究院有限公司拥有经济利益,但该公司并不支持这项工作。其他作者声明没有竞争利益。
Acknowledgments
本研究由广东省药物非临床评价与研究重点实验室(No.2018B030323024)和广东省重点研发计划“新药创制”重点项目(No.2019B020202001)、广州市基础与应用基金会研究项目(No.202002030249、No.202002030156)资助。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.0 mL syringe (with needle, 26 G, 0.45 mm x 15.5 mm) | Jiangxi Hongda Medical Equipment Group LTD.(Nanchang, Jiangxi Province, China) | 20210629 | |
75% alcohol | Shandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd. (Dezhou, Shandong Province, China) | 210717 | |
Animal source | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. | grade: SPF | laboratory animal production license number: SCXK (Hunan) 2019-0004, laboratory animal quality certificate number: 4307272101972847 |
Cotton swab | Caoxian Hualu Sanitary Materials Co., Ltd.(Heze, Shandong Province, China) | 20210301 | Need to be sterilized. |
Electric shaver | Shenzhen Codos Electric Appliance Co. , Ltd.(Shenzhen, Guangdong Province, China) | CP-6800 | |
EP tube, 1.5 mL | Genetimes ExCell Technology,Inc.(Shanghai, China) | ||
Heparin sodium (2 mL:12500 IU) | Tianjin biochem pharmaceutical Co.,Ltd(Tianjing, China) | 51200702 | Prepare 1250 IU/mL heparin sodium solution. Add heparin sodium solution into the EP tube in advance and make it evenly distributed on the wall of the EP tube, and dry it at 60°C for use. |
Labtip (volume range 5-200 μL) | Thermo Fisher Scientific Oy | 94300120 | |
Low speed refrigerated centrifuge | Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.(Changsha, Hunan Province, China) | L535R | |
Pipette gun (20-200 μL) | BRAND | 12N92305 | |
Rats (SD) | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. (Changsha, Hunan Province, China) | ||
Sharp tool container | Taizhou Huangyan Yikang Plastic Factory (Taizhou, Zhejiang Province, China) | ||
Eye drop | This reagent is not a commodity and the manufacturer requires it to be tested. In the principle of confidentiality, the manufacturer and model cannot be provided. |
References
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