Markierungsfreie nichtlineare Optik zur Untersuchung von Tubulin-abhängigen Defekten im zentralen Myelin

Summary

In diesem Artikel stellen wir ein Protokoll zum Nachweis von Mikrotubuli-beladenen Oligodendrozyten in einem Modell der Tubulinopathie durch einen einfachen, innovativen Mikroskopieansatz der zweiten harmonischen Generation vor.

Abstract

Die zufriedenstellende Visualisierung von Zytoskelettkomponenten im Gehirn ist eine Herausforderung. Die ubiquitäre Verteilung der Netzwerke von Mikrotubuli, Mikrofilamenten und intermediären Filamenten in allen neuronalen Geweben, zusammen mit der Variabilität der Ergebnisse von fluoreszierenden Proteinfusionsstrategien und ihrer begrenzten Anwendbarkeit auf dynamische Studien von Antikörpern und Medikamenten als Chromophorvehikel, machen klassische optische Ansätze nicht so effektiv wie für andere Proteine. Wenn Tubulin untersucht werden muss, ist die markierungsfreie Erzeugung von zweiten Oberschwingungen aufgrund der nicht-zentrosymmetrischen Organisation des Moleküls eine sehr geeignete Option. Diese Technik kann, wenn sie mit der Mikroskopie konjugiert wird, die volumetrische Verteilung paralleler Bündel von Mikrotubuli in biologischen Proben qualitativ beschreiben, mit dem zusätzlichen Vorteil, mit frischem Gewebe zu arbeiten, das nicht fixiert und nicht permeabilisiert ist. Diese Arbeit beschreibt, wie Tubulin mit einem kommerziellen Mikroskopieaufbau der zweiten harmonischen Generation abgebildet werden kann, um Mikrotubuli in den mit Tubulin angereicherten Strukturen der Oligodendrozyten hervorzuheben, wie bei der Hypomyelinisierung mit Atrophie der Basalganglien und der Tbulinopathie des Kleinhirns (H-ABC), einer kürzlich beschriebenen Myelinerkrankung.

Introduction

Die optische Bildgebung von Zytoskelettstrukturen in Geweben und Organpräparaten ist keine leichte Aufgabe. Zytoskelettfilamente sind allgegenwärtig, so dass, wenn eine generische Färbung durchgeführt wird, zum Beispiel gegen Alpha-Tubulin oder Beta-Aktin oder möglicherweise Keratin in einer Epithelprobe, das Signal wahrscheinlich ziemlich homogen über die gesamte Probe verteilt wird. Um die Färbung auf eine aussagekräftigere Teilmenge zellulärer Komponenten zu beschränken, kann man entweder transgene Mäuse mit gezielter Expression¹ verwenden oder isoformspezifische Antikörper verwenden. Während nur sehr wenige der letzteren auf dem Markt sind (und nur sehr wenige existieren ^2,3,4), könnte ein transgenes Tiermodell verfügbar sein. Es muss jedoch vom Labor erworben und ordnungsgemäß untergebracht werden, mit allen Kosten, die mit dem Prozess verbunden sind. Bestimmte Antikörper oder Chemikalien, z. B. Fluorophor-konjugierte Arzneimittel wie Phalloidin oder Paclitaxel, können teilweise oder vollständig mit der Anwendung in lebenden Zellen oder Geweben unvereinbar sein, so dass ihre Anwendbarkeit auf Studien an festen Proben beschränkt ist.

Im Falle von Tubulin muss ein weiterer Aspekt berücksichtigt werden, nämlich die Empfindlichkeit des Polymers gegenüber der Fixierung. Die konventionelle chemische Fixierung mit Formaldehyd ist dafür bekannt, dass sie nicht ausreicht, um die Integrität von Mikrotubuli optimal zu erhalten⁵. Darüber hinaus bestätigt ein kürzlich veröffentlichter Bericht, dass die Formaldehydvernetzung subtile Veränderungen in der Ultrastruktur des Mikrotubuli induziert, ähnlich wie bei der Bindung einiger Medikamente oder physiologischer Moleküle wie GTP⁶.

Die direkte Visualisierung von Mikrotubuli in ungefärbten, nicht fixierten Proben ist daher oft wünschenswert. Um dies zu erreichen, ist die Mikroskopie der zweiten harmonischen Generation (SHG)⁷, die auf der Fähigkeit von Bündeln paralleler Mikrotubuli basiert, als Harmonophore zu fungieren und frequenzverdoppeltes Licht zu emittieren, wenn sie mit einem intensiven, gepulsten Infrarotlaser richtig beleuchtet werden. Obwohl ein stärkeres und stabileres Signal der zweiten Harmonischen aus Kollagen und Myosin erzeugt werden kann, die die einzigen beiden anderen biologischen Materialien sind, von denen bekannt ist, dass sie zur Frequenzverdopplung fähig sind, wurde das Signal von Tubulin bisher hauptsächlich verwendet, um mitotische Spindelumlagerungen ^8,9,10 und axonale Mikrotubuli^{Morphologie 11,12,13} zu untersuchen.

In dieser Arbeit stellen wir eine neuartige Anwendung der SHG-Mikroskopie als diagnostisches Werkzeug vor, um Gewebe des zentralen Nervensystems (ZNS), die von Tubulin-beta-4-A (TUBB4A)-Tubulinopathie betroffen sind, von ihren gesunden Gegenstücken^{zu unterscheiden 14}. Einige der Mutationen, die in dieser überwiegend neuralen Isoform von Tubulin auftreten, wie diejenigen, die Hypomyelinisierung und Atrophie der Basalganglien und des Kleinhirns (H-ABC) verursachen, induzieren eine Überfüllung der Mikrotubuli in den Oligodendrozyten^15,16; Die Veränderungen des Zytoskeletts sind wiederum mit nachgeschalteten Effekten wie Dysmyelinisierung verbunden, mit einer tiefgreifenden Beeinträchtigung der motorischen und sensorischen Bahnen^16,17,18,19. Das de dieser Arbeit verwendete Taiep-Mausmodell zeigt einen abnormalen Mikrotubuli-Gehalt in den Oligodendrozyten und rekapituliert die meisten sensomotorischen Symptome von H-ABC-Patienten¹⁷. Das Protokoll erklärt, wie Strukturen wie das Corpus callosum und das Kleinhirn, die normalerweise stark myelinisiert sind und die sowohl bei menschlichen Patienten als auch bei der Taiep-Ratte ¹⁹ stark betroffen sind, abgebildet werden können, um die Unterschiede in den SH-Signalen zwischen gesundem und mutiertem Gewebe hervorzuheben.

Protocol

Alle beschriebenen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Gesetzen und Kodizes durchgeführt, die im siebten Titel der Verordnung des Allgemeinen Gesundheitsgesetzes über die Gesundheitsforschung der mexikanischen Regierung (NOM-062-ZOO-1999) genehmigt wurden, und in Übereinstimmung mit den Empfehlungen des Leitfadens der Nationalen Gesundheitsinstitute für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren und wurden vom institutionellen Ausschuss für Bioethik in der Forschung der Universidad de Guanajuato und der B…

Representative Results

Die mit dieser Methodik erhaltenen Bilder weisen aufgrund der sehr begrenzten Anzahl von Harmonophoren, die in biologischen Geweben vorhanden sind, ein intrinsisch niedriges Hintergrundniveau auf, was einer der wesentlichen Vorteile der Methode ist. Wenn die Fasern des Corpus callosum abgebildet werden, finden sich im Taiep-Gehirn durchweg faserartige Kurzstrukturen und abgerundete Elemente (Abbildung 3B), während das Corpus callosum des Kontrollgehirns ein viel heterogeneres und iso…

Discussion

Die SHG-Mikroskopie ist Teil einer Gruppe nichtlinearer optischer Techniken, zu denen die Zwei-Photonen-Anregungsmikroskopie, die Mikroskopie der dritten harmonischen Generation und die kohärente Anti-Stokes-Raman-Streumikroskopie gehören, die dazu beigetragen haben, das Anwendungsspektrum der konventionellen optischen Mikroskopie auf die Biowissenschaften auszudehnen²⁰.

Insbesondere beziehen sich die Hauptstärken und Schwächen der SHG-Mikroskopie auf die gleiche Be…

Materials

405/10 nm BrightLine(R) single-band bandpass filter	Semrock	FF01-405/10-25	32 mm diameter, with housing ring
Black Nylon, Polyurethane-Coated Fabric	Thorlabs	BK5	5' x 9' (1.5 m x 2.7 m) x 0.005" (0.12 mm) Thick
Blades for vibratome	any commercial; e.g. Wilkinson Sword		Classic stainless steel double edge razor blades
Cell culture dishes, 35 mm	any commercial; e.g. Falcon	351008
Confocal microscope	Zeiss	LSM710NLO AxioObserver Z1	Inverted microscope, objective used is LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA
Cooler	any commercial		Any insulated, polystyrene box could work, to mantain the sample at about 37 °C
Corn stach	e.g. Maizena		From the supermarket
Coverslips #1.5	any commercial		Rectangular
Cyanoacrylate glue	e.g. Loctite		To glue the brain to the masking tape
Fine forceps	fine science tools	11412-11	To manipulate tissue sections by handling from the meninges
Fine scissors	fine science tools	14370-22	To cut the skin
Fine scissors curved tip	fine science tools	14061-09	To cut along the midline
Formaldehyde 37%	Sigma-Aldrich	252549	To dilute 1:10 in PBS
Friedman Rongeur	fine science tools	16000-14	To cut the bone
Gel packs	any commercial		Prewarmed to 37 °C, to help mantaining the temperature inside the cooler
Glass Pasteur pipette, modified	any commercial		To transfer the tissue section
Hanks′ Balanced Salt solution (HBSS)	Gibco	14025-076	Could be prepared from powders
Kelly hemostats	fine science tools	13018-14	To separate the bone
Masking tape	any commercial		To protect th surface of the specimen plate
NDD module, type C	Zeiss	000000-1410-101	To detect the signal, reducing light loss. Housing the 000000-1935-163 filter set with the SP485
Offset bone nippers	fine science tools	16101-10	To cut the bone
Phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	10010-031	Could be prepared from powders or tabs
Pulsed laser	Coherent	Chameleon Vision II	680–1080 nm tunable laser
Scalpel	any commercial		Straight blade with sharp point
Standard pattern forceps	fine science tools	11000-18
Vannas spring scissors	fine science tools	15018-10	To cut meninges that remain joined to both the slice obtained from vibratome cutting and the section glued to the specimen plate.
Vibratome	any commercial; e.g. Leica	VT1200