中枢ミエリンにおけるチューブリン依存性欠陥の研究のためのラベルフリー非線形光学系
Summary
本稿では、細管障害のモデルで微小管を負荷した希突起膠細胞を、シンプルで革新的な第2高調波発生顕微鏡アプローチで検出するためのプロトコルを紹介します。
Abstract
脳内の細胞骨格成分を十分に可視化することは困難です。すべての神経組織における微小管、マイクロフィラメント、および中間フィラメントのネットワークの遍在する分布は、蛍光タンパク質融合戦略の結果のばらつきと、発色団ビヒクルとしての抗体および薬物の動的研究へのそれらの限られた適用性とともに、古典的な光学的アプローチを他のタンパク質ほど効果的ではないものにします。チューブリンを研究する必要がある場合、分子の非中心対称組織化のために、ラベルフリーの第二高調波の生成は非常に適切な選択肢です。この手法を顕微鏡に結合させると、生物学的サンプル中の微小管の平行な束の体積分布を定性的に記述でき、固定および透過性のない新鮮な組織を扱うという追加の利点があります。この研究では、最近報告されたミエリン障害である大脳基底核および小脳(H-ABC)チューブリノパシーの萎縮を伴う髄鞘形成低下のように、希突起膠細胞のチューブリンが豊富な構造の微小管を強調するために、市販の第2倍音発生顕微鏡セットアップでチューブリンを画像化する方法について説明します。
Introduction
組織や臓器製剤中の細胞骨格構造の光学イメージングは簡単な作業ではありません。細胞骨格フィラメントはいたるところにあるため、例えば、上皮サンプル中のα-チューブリンまたはβ-アクチン、または潜在的にケラチンに対して一般的な染色が行われる場合、シグナルはサンプル全体にかなり均一に分布する可能性があります。染色を細胞成分のより意味のあるサブセットに制限するには、標的発現1のトランスジェニックマウスを使用するか、アイソフォーム特異的抗体の使用を計画することができます。後者のほとんどが市場に出回っていませんが(そして、まったく存在しないものはほとんどありません2,3,4)、トランスジェニック動物モデルが利用可能である可能性があります。ただし、ラボで取得し、適切に収容する必要があり、プロセスにすべての費用がかかります。特定の抗体または化学物質、例えばファロイジンやパクリタキセルなどの蛍光色素結合薬物は、生細胞または組織での使用と部分的または完全に適合しない可能性があるため、固定サンプルの研究のみに適用できます。
チューブリンの場合、追加の側面、すなわち固定に対するポリマーの感受性を考慮する必要があります。ホルムアルデヒドによる従来の化学的固定は、微小管の完全性を最適に保存するのに十分ではないことが知られています5。さらに、最近の報告では、ホルムアルデヒド架橋が、GTP6などの一部の薬物または生理学的分子の結合で起こるのと同様に、微小管の微細構造に微妙な変化を誘発することが確認されています。
したがって、染色されていない、固定されていないサンプル中の微小管を直接可視化することがしばしば望ましいです。これを達成するための技術的解決策の1つは、平行な微小管の束がハーモノフォアとして機能し、強力なパルス赤外線レーザーで適切に照らされたときに周波数倍の光を放出する能力に基づく第2高調波発生(SHG)顕微鏡7です。周波数倍増が可能なことが知られている他の2つの生物学的材料であるコラーゲンとミオシンから、より強力でより安定した第2高調波信号を生成できますが、チューブリンからの信号は、これまで主に有糸分裂紡錘体再配列8,9,10および軸索微小管形態11,12,13の研究に使用されてきました。
この研究では、チューブリンベータ4A(TUBB4A)チューブリノパシーの影響を受けた中枢神経系(CNS)組織を健康な組織と区別するための診断ツールとしてのSHG顕微鏡の新しい使用法を紹介します14。この主に神経アイソフォームのチューブリンで発生する変異のいくつかは、大脳基底核および小脳(H-ABC)の髄鞘形成低下および萎縮を引き起こすものと同様に、希突起膠細胞の微小管の過剰充填を誘発します15,16;次に、細胞骨格の変化は、髄鞘形成などの下流効果に関連しており、運動経路と感覚経路の深刻な障害を伴います16,17,18,19。本研究で用いたマウスモデルは、希突起膠細胞の微小管含量の異常を示し、H-ABC患者の感覚運動症状のほとんどを再現している17。プロトコルは、健康な組織と変異組織の間のSH信号の違いを強調するために、通常は高度に有髄性であり、ヒト患者およびtaiepラット19で深刻な影響を受ける脳梁および小脳として構造を画像化する方法を説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
SHG顕微鏡は、2光子励起顕微鏡、第3高調波発生顕微鏡、コヒーレント反ストークスラマン散乱顕微鏡などの非線形光学技術のグループの一部であり、従来の光学顕微鏡のライフサイエンスへの応用範囲の拡大に貢献してきました20。
具体的には、SHG顕微鏡の主な長所と短所は同じ条件に関連しています:信号発生器は非中心対称です21。?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología(CONACYT)によって、次の助成金を通じて支援されました:VP-CIOへのインフラ構造226450、VPへのインフラ構造255277、およびFORDECYT-PRONACES/194171/2020からV.H.。私たちは、ビデオ制作におけるCIOのJuvenal Hernández Guevaraのサポートに感謝します。
Materials
| 405/10 nm BrightLine(R) single-band bandpass filter | Semrock | FF01-405/10-25 | 32 mm diameter, with housing ring |
| Black Nylon, Polyurethane-Coated Fabric | Thorlabs | BK5 | 5' x 9' (1.5 m x 2.7 m) x 0.005" (0.12 mm) Thick |
| Blades for vibratome | any commercial; e.g. Wilkinson Sword | Classic stainless steel double edge razor blades | |
| Cell culture dishes, 35 mm | any commercial; e.g. Falcon | 351008 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM710NLO AxioObserver Z1 | Inverted microscope, objective used is LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA |
| Cooler | any commercial | Any insulated, polystyrene box could work, to mantain the sample at about 37 °C | |
| Corn stach | e.g. Maizena | From the supermarket | |
| Coverslips #1.5 | any commercial | Rectangular | |
| Cyanoacrylate glue | e.g. Loctite | To glue the brain to the masking tape | |
| Fine forceps | fine science tools | 11412-11 | To manipulate tissue sections by handling from the meninges |
| Fine scissors | fine science tools | 14370-22 | To cut the skin |
| Fine scissors curved tip | fine science tools | 14061-09 | To cut along the midline |
| Formaldehyde 37% | Sigma-Aldrich | 252549 | To dilute 1:10 in PBS |
| Friedman Rongeur | fine science tools | 16000-14 | To cut the bone |
| Gel packs | any commercial | Prewarmed to 37 °C, to help mantaining the temperature inside the cooler | |
| Glass Pasteur pipette, modified | any commercial | To transfer the tissue section | |
| Hanks′ Balanced Salt solution (HBSS) | Gibco | 14025-076 | Could be prepared from powders |
| Kelly hemostats | fine science tools | 13018-14 | To separate the bone |
| Masking tape | any commercial | To protect th surface of the specimen plate | |
| NDD module, type C | Zeiss | 000000-1410-101 | To detect the signal, reducing light loss. Housing the 000000-1935-163 filter set with the SP485 |
| Offset bone nippers | fine science tools | 16101-10 | To cut the bone |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-031 | Could be prepared from powders or tabs |
| Pulsed laser | Coherent | Chameleon Vision II | 680–1080 nm tunable laser |
| Scalpel | any commercial | Straight blade with sharp point | |
| Standard pattern forceps | fine science tools | 11000-18 | |
| Vannas spring scissors | fine science tools | 15018-10 | To cut meninges that remain joined to both the slice obtained from vibratome cutting and the section glued to the specimen plate. |
| Vibratome | any commercial; e.g. Leica | VT1200 |
Referências
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