تقييم علامة حيوية موثوقة في نموذج فأر للإنتان الناجم عن الربط وثقب
Summary
يقدم هذا البروتوكول التفاصيل التشغيلية لربط وثقب cecal (CLP) في نموذج فأر من الإنتان. CLP هي واحدة من أكثر التقنيات المستخدمة على نطاق واسع لإنشاء نموذج حيواني للإنتان. لذلك ، يلزم وجود بروتوكول CLP موحد لتحقيق نتائج بحثية موثوقة.
Abstract
الإنتان هو مرض خطير يهدد الحياة ويتطور بسرعة ويسبب ملايين الوفيات سنويا في جميع أنحاء العالم. بذل الباحثون جهودا هائلة لتوضيح الفيزيولوجيا المرضية للإنتان باستخدام نماذج حيوانية مختلفة. يستخدم نموذج الفأر للإنتان الناجم عن ربط وثقب cecal (CLP) على نطاق واسع في المختبرات. الجوانب التقنية الثلاثة التي تؤثر على شدة وتكرار نموذج CLP هي النسبة المئوية للعرقور المربوط ، وحجم الإبرة المستخدمة في ثقب cecal ، وحجم البراز المعصور في تجويف البطن. التشخيص السريع والمحدد للإنتان هو عامل حاسم يؤثر على النتيجة. المعيار الذهبي لتشخيص الإنتان هو الثقافة الميكروبية. ومع ذلك ، فإن هذه العملية تستغرق وقتا طويلا وأحيانا غير دقيقة. يتم الكشف عن المؤشرات الحيوية الخاصة بالإنتان بسرعة ، لكن المؤشرات الحيوية الحالية غير مرضية بسبب عمر النصف القصير ، وعدم الخصوصية ، والحساسية غير الكافية. لذلك ، هناك حاجة ملحة لعلامة حيوية موثوقة للإنتان في المراحل المبكرة. تشير المنشورات السابقة إلى أن مصائد العدلات خارج الخلية المفرطة (NETs) تحدث في الإنتان. يتم رفع هيستون H3 (CitH3) ، كمكون NET ، في كل من الصرف الصحي والمرضى ، ووجود CitH3 هو علامة حيوية تشخيصية موثوقة للإنتان. تهدف الدراسة الحالية إلى وصف نموذج فأر موحد للإنتان الناجم عن CLP وإنشاء علامة حيوية موثوقة للدم للإنتان. قد يساهم عملنا في التشخيص المبكر والدقيق للإنتان في المستقبل.
Introduction
يعرف الإنتان بأنه خلل وظيفي في الأعضاء يهدد الحياة ناتج عن استجابة المضيف غير المنظمة للعدوى1 ، والصدمة الإنتانية هي السبب الرئيسي للوفاة في الحالات الشديدة من الإنتان2. يتسبب الإنتان والصدمة الإنتانية في ملايين الوفيات في جميع أنحاء العالم كل عام3. المفتاح لتحسين نتائج المرضى الذين يعانون من الإنتان هو البدء الفوري للعلاجات مثل المضادات الحيوية4. الطريقة القياسية الذهبية لتشخيص الإنتان هي الثقافة الميكروبية. ومع ذلك ، فإن الثقافة الميكروبية تستغرق وقتا طويلا ويمكن أن تؤدي إلى نتائج إيجابية كاذبة وسلبية كاذبة ، مما يحد بشكل كبير من الأهمية السريرية5. وبالتالي ، فمن المستحسن للغاية تحديد علامة حيوية الدم من الإنتان. يعرف البروكالسيتونين بأنه علامة حيوية مثالية للإنتان ولكن له فعالية تشخيصية محدودة لأنه غير قادر على التمييز بين الإنتان والأمراض المعقمة6.
يشيع استخدام ربط وثقب الفأر (CLP) لإنشاء نموذج للإنتان في البحث العلمي. CLP هو أحد أكثر نماذج الإنتان استخداما لأنه يحاكي التهاب الصفاق متعدد الميكروبات ، وينشط كل من الاستجابات المناعية الالتهابية والمضادة للالتهابات7. من المقبول جيدا أن CLP يخلق نموذج تعفن الدم أكثر ملاءمة سريريا من التقنيات البديلة ، مثل حقن السموم الداخلية البكتيرية. لذلك ، يعتبر CLP نموذج الإنتان الكلاسيكي للاستخدام في البحث8. ومع ذلك ، فإن العيب الرئيسي ل CLP هو قابليته للتكاثر ، حيث تتأثر شدة النموذج بعدة عوامل مثل النسبة المئوية لربط الأعور ، وحجم الإبرة ، وعدد الثقوب ، وتقنية فتح البطن. لذلك ، هناك حاجة لتوحيد نموذج الإنتان الناجم عن CLP. تصف الدراسة الحالية تفاصيل بروتوكول نموذج الإنتان الناجم عن CLP لإظهار الإجراء الموحد وزيادة قابليته للتكاثر.
تحدث الاستجابة الالتهابية في المرحلة المبكرة من الإنتان ، حيث تطلق العدلات كميات زائدة من المؤكسدات والبروتياز التي تسبب تلف الأعضاء8. أحد العوامل الرئيسية في الفيزيولوجيا المرضية للإنتان هو تكوين مصائد العدلات خارج الخلية (NETs) ، والتي تطلق مكونات نووية وخلوية مثل الحمض النووي ، وهيستون الحمضيات ، والبروتينات المضادة للميكروبات9. تشير الدراسات الحديثة إلى أن التوليد المفرط للشبكات يتوسط في أمراض الإنتان. وفي الوقت نفسه ، فإن انخفاض NETs ، من خلال التثبيط الأنزيمي للببتيديل أرجينين ديميناز (PAD) بواسطة مواد كيميائية مثل YW3-56 أو Cl-amidine ، يمارس تأثيرا مؤيدا للبقاء في نماذج الفئران من الإنتان10,11. تم تحديد هيستون H3 (CitH3) كبروتين خاص بالإنتان في عام 201112 ، وقد أظهرت المنشورات اللاحقة أن تركيز CitH3 المتداول هو علامة حيوية تشخيصية موثوقة للإنتان13,14. يعتبر CitH3 علامة حيوية أكثر حساسية وطويلة الأمد من البروكالسيتونين ، وهو أكثر تحديدا في تمييز الإنتان من السيتوكينات الالتهابية13.
في هذه الدراسة ، قمنا بتقييم علامة حيوية تشخيصية موثوقة للإنتان في نموذج فأر ناتج عن CLP للإنتان.
Protocol
Representative Results
Discussion
يدخل CLP مسببات الأمراض في البطن لإنشاء نموذج ما قبل السريري للإنتان. عند إجراء CLP ، من المهم استخدام ظروف معقمة للقضاء على تداخل البكتيريا الخارجية واستخدام جرعات دقيقة من التخدير16. الجوانب التقنية الثلاثة ل CLP التي تؤثر على شدة نموذج الإنتان وإمكانية تكراره هي النسبة المئوية …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر البروفيسور وانغ وي والدكتور ليو شواي للمساعدة في التجارب. تم تمويل هذا العمل من خلال منح من تمويل أبحاث الشباب في مستشفى Xiangya ، جامعة سنترال ساوث (رقم 2019Q10) ، ومن المؤسسة الوطنية والعلوم في مقاطعة هونان (رقم 2020JJ4902) ، ومن المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 82202394).
Materials
| 21G needle | |||
| 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine | R&D Systems Inc | DY999 | |
| anti-CitH3 monoclonal antibody | laboratory self developed | ||
| anti-CitH3 polyclonal antibody | Abcam | ab5103 | |
| anti-rabbit secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-035-003 | |
| C57BL/6 mice | Xiangya School of Medicine, Central South University | ||
| Cl-amidine | Sigma Aldrich | SML2250 | |
| depilatory cream | |||
| Dnase I | Sigma Aldrich | 11284932001 | |
| isoflurane | Sigma-Aldrich | 26675-46-7 | |
| ketoprofen | Sigma Aldrich | PHR1375 | |
| silk sutures (4-0 & 6-0) | |||
| surgical instruments | |||
| YW3-56 | GLPBIO | GC48263 |
Referências
- Singer, M., et al. The third international consensus definitions for sepsis and septic shock (Sepsis-3). JAMA. 315 (8), 801-810 (2016).
- Shankar-Hari, M., et al. Developing a new definition and assessing new clinical criteria for septic shock: For the Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3). JAMA. 315 (8), 775-787 (2016).
- Fleischmann-Struzek, C., et al. Incidence and mortality of hospital- and ICU-treated sepsis: results from an updated and expanded systematic review and meta-analysis. Intensive Care Medicine. 46 (8), 1552-1562 (2020).
- Evans, L., et al. Surviving sepsis campaign: international guidelines for management of sepsis and septic shock 2021. Intensive Care Medicine. 47 (11), 1181-1247 (2021).
- Hughes, J. A., Cabilan, C. J., Williams, J., Ray, M., Coyer, F. The effectiveness of interventions to reduce peripheral blood culture contamination in acute care: a systematic review protocol. Systematic Reviews. 7 (1), 216 (2018).
- Kibe, S., Adams, K., Barlow, G. Diagnostic and prognostic biomarkers of sepsis in critical care. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 66, 33-40 (2011).
- Dejager, L., Pinheiro, I., Dejonckheere, E., Libert, C. Cecal ligation and puncture: the gold standard model for polymicrobial sepsis. Trends in Microbiology. 19 (4), 198-208 (2011).
- Hotchkiss, R., Karl, I. The pathophysiology and treatment of sepsis. The New England Journal of Medicine. 348 (2), 138-150 (2003).
- Madhi, R., Rahman, M., Taha, D., Morgelin, M., Thorlacius, H. Targeting peptidylarginine deiminase reduces neutrophil extracellular trap formation and tissue injury in severe acute pancreatitis. Journal of Cellular Physiology. 234 (7), 11850-11860 (2019).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Liang, Y., et al. Inhibition of peptidylarginine deiminase alleviates LPS-induced pulmonary dysfunction and improves survival in a mouse model of lethal endotoxemia. European Journal of Pharmacology. 833, 432-440 (2018).
- Deng, Q., et al. Citrullinated histone H3 as a therapeutic target for endotoxic shock in mice. Frontiers in Immunology. 10, 2957 (2019).
- Li, Y. Q., et al. Identification of citrullinated histone H3 as a potential serum protein biomarker in a lethal model of lipopolysaccharide-induced shock. Surgery. 150 (3), 442-451 (2011).
- Pan, B., et al. CitH3: a reliable blood biomarker for diagnosis and treatment of endotoxic shock. Scientific Reports. 7 (1), 8972 (2017).
- Park, Y., et al. An integrated plasmo-photoelectronic nanostructure biosensor detects an infection biomarker accompanying cell death in neutrophils. Small. 16 (1), 1905611 (2020).
- Harikrishnan, V. S., Hansen, A. K., Abelson, K. S. P., Sorensen, D. B. A comparison of various methods of blood sampling in mice and rats: Effects on animal welfare. Laboratory Animals. 52 (3), 253-264 (2018).
- Brook, B., et al. A controlled mouse model for neonatal polymicrobial sepsis. Journal of Visualized Experiments. (143), e58574 (2019).
- Rittirsch, D., Huber-Lang, M., Flierl, M., Ward, P. Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture. Nature Protocols. 4 (1), 31-36 (2009).
- Baker, C. C., Chaudry, I. H., Gaines, H. O., Baue, A. E. Evaluation of factors affecting mortality rate after sepsis in a murine cecal ligation and puncture model. Surgery. 94 (2), 331-335 (1983).
