패혈증의 맹장 결찰 및 천자 유도 마우스 모델에서 신뢰할 수 있는 바이오마커의 평가
Summary
이 프로토콜은 패혈증의 마우스 모델에서 맹장 결찰 및 천자 (CLP)의 수술 세부 사항을 제시합니다. CLP는 패혈증의 동물 모델을 만들기 위해 가장 널리 사용되는 기술 중 하나입니다. 따라서 신뢰할 수 있는 연구 결과를 얻으려면 표준화된 CLP 프로토콜이 필요합니다.
Abstract
패혈증은 생명을 위협하고 빠르게 발전하는 심각한 질병으로 전 세계적으로 매년 수백만 명이 사망합니다. 연구자들은 다양한 동물 모델을 사용하여 패혈증의 병태생리학을 밝히기 위해 엄청난 노력을 기울였습니다. 맹장 결찰 및 천자 (CLP)에 의해 유도 된 패혈증의 마우스 모델은 실험실에서 널리 사용됩니다. CLP 모델의 심각도와 재현성에 영향을 미치는 세 가지 기술적 측면은 맹장 결찰의 비율, 맹장 천자에 사용되는 바늘의 크기 및 복강 내로 압착 된 대변의 양입니다. 패혈증의 신속하고 구체적인 진단은 결과에 영향을 미치는 중요한 요소입니다. 패혈증 진단의 황금 표준은 미생물 배양입니다. 그러나이 프로세스는 시간이 많이 걸리고 때로는 정확하지 않습니다. 패혈증 특이적 바이오마커의 검출은 빠르지만, 기존 바이오마커는 짧은 반감기, 비특이성 및 불충분한 민감도로 인해 만족스럽지 못하다. 따라서, 초기 단계에서 패혈증의 신뢰성 있는 바이오마커에 대한 절실한 필요성이 있다. 이전 간행물은 과도한 호중구 세포 외 트랩 (NET)이 패혈증에서 발생한다고 제안합니다. 시트룰린화 히스톤 H3(CitH3)는 NET 성분으로서 패혈증 동물과 환자 모두에서 상승하며, CitH3의 존재는 패혈증의 신뢰할 수 있는 진단 바이오마커입니다. 본 연구는 CLP 유발 패혈증의 표준화된 마우스 모델을 기술하고 패혈증의 신뢰할 수 있는 혈액 바이오마커를 확립하는 것을 목표로 했습니다. 우리의 연구는 미래에 패혈증의 조기 및 정확한 진단에 기여할 수 있습니다.
Introduction
패혈증은 감염1에 대한 조절되지 않는 숙주 반응으로 인한 생명을 위협하는 장기 기능 장애로 정의되며, 패혈성 쇼크는 패혈증2의 심각한 경우 주요 사망 원인입니다. 패혈증 및 패혈성 쇼크는 매년 전 세계적으로 수백만 명의 사망을 초래합니다3. 패혈증 환자의 결과를 개선하는 열쇠는 항생제4와 같은 치료의 즉각적인 시작입니다. 패혈증 진단을위한 황금 표준 방법은 미생물 배양입니다. 그러나 미생물 배양은 시간이 많이 걸리고 위양성 및 위음성 결과를 초래할 수 있어 임상적 중요성을 크게 제한할 수있습니다5. 따라서, 패혈증의 혈액 바이오마커를 동정하는 것이 매우 바람직하다. 프로칼시토닌은 이상적인 패혈증 바이오마커로 인식되고 있으나 패혈증과 멸균 질환을 구별할 수 없기 때문에 진단 효능이 제한적이다6.
마우스 맹장 결찰 및 천자 (CLP)는 일반적으로 과학 연구에서 패혈증 모델을 만드는 데 사용됩니다. CLP는 다발성 미생물 복막염을 모방하여 전염증 및 항염증면역 반응을 모두 활성화하기 때문에 가장 널리 사용되는 패혈증 모델 중 하나입니다7. CLP가 박테리아 내 독소 주입과 같은 대체 기술보다 임상 적으로 더 관련성이 높은 패혈증 모델을 생성한다는 것은 잘 알려져 있습니다. 따라서, CLP는 연구8에서 사용하기 위한 고전적 패혈증 모델로 간주된다. 그러나 CLP의 주요 단점은 모델 심각도가 맹장 결찰 비율, 바늘 크기, 천자 수 및 개복술 기술과 같은 여러 요인의 영향을 받기 때문에 재현성입니다. 따라서, CLP 유발 패혈증 모델을 표준화할 필요가 있다. 본 연구는 표준화된 절차를 보여주고 그의 재현성을 증가시키기 위해 CLP-유도된 패혈증 모델의 프로토콜 세부사항을 기술한다.
염증 반응은 패혈증의 초기 단계에서 발생하며, 호중구는 장기 손상을 일으키는 과도한 양의 산화제와 프로테아제를 방출합니다8. 패혈증의 병태생리학의 핵심 인자는 DNA, 시트룰린화 히스톤 및 항균 프로테이나제9와 같은 핵 및 세포질 성분을 방출하는 호중구 세포외 트랩(NET)의 형성이다. 최근 연구에 따르면 NET의 과도한 생성은 패혈증의 병리를 매개합니다. 한편, YW3-56 또는 Cl-아미딘과 같은 화학 물질에 의한 펩티딜 아르기닌 데이미나제(PAD)의 효소적 억제를 통한 NET의 감소는 패혈증10,11의 마우스 모델에서 생존 촉진 효과를 발휘합니다. 시트룰린화 히스톤 H3(CitH3)는 2011년12월에 패혈증 특이적 단백질로 확인되었으며, 후속 간행물에서는 순환 CitH3 농도가 패혈증13,14의 신뢰할 수 있는 진단 바이오마커임을 입증했습니다. CitH3는 프로칼시토닌보다 더 민감하고 오래 지속되는 바이오마커로 간주되며, 염증성 사이토카인13보다 패혈증을 구별하는데 더 특이적이다.
이 연구에서, 우리는 패혈증의 CLP 유도 마우스 모델에서 패혈증의 신뢰할 수있는 진단 바이오 마커를 평가했습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
CLP는 패혈증의 전임상 모델을 만들기 위해 복부에 병원체를 도입합니다. CLP를 수행 할 때, 외인성 박테리아의 간섭을 제거하고 정확한 마취제16을 사용하기 위해 멸균 조건을 사용하는 것이 중요하다. 패혈증 모델의 중증도와 재현성에 영향을 미치는 CLP의 세 가지 기술적 측면은 결찰 된 맹장의 비율, 맹장 천자에 사용되는 바늘의 크기 및 복강으로 압착 된 대변의 양입니다. 맹?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
실험을 도와주신 왕웨이 교수님과 류슈아이 박사님께 감사드립니다. 이 연구는 중남대학교 샹야 병원 청년연구기금(2019Q10), 후난성 국립과학재단(2020JJ4902), 중국 국립자연과학재단(제10 82202394호)의 보조금으로 지원받았다.
Materials
| 21G needle | |||
| 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine | R&D Systems Inc | DY999 | |
| anti-CitH3 monoclonal antibody | laboratory self developed | ||
| anti-CitH3 polyclonal antibody | Abcam | ab5103 | |
| anti-rabbit secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-035-003 | |
| C57BL/6 mice | Xiangya School of Medicine, Central South University | ||
| Cl-amidine | Sigma Aldrich | SML2250 | |
| depilatory cream | |||
| Dnase I | Sigma Aldrich | 11284932001 | |
| isoflurane | Sigma-Aldrich | 26675-46-7 | |
| ketoprofen | Sigma Aldrich | PHR1375 | |
| silk sutures (4-0 & 6-0) | |||
| surgical instruments | |||
| YW3-56 | GLPBIO | GC48263 |
Referências
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