Evaluering af en pålidelig biomarkør i en cecal ligerings- og punkteringsinduceret musemodel af sepsis

Summary

Denne protokol præsenterer de operative detaljer om cecal ligering og punktering (CLP) i en musemodel af sepsis. CLP er en af de mest anvendte teknikker til at skabe en dyremodel af sepsis. Derfor kræves en standardiseret CLP-protokol for at opnå pålidelige forskningsresultater.

Abstract

Sepsis er en alvorlig livstruende og hurtigt udviklende sygdom, der forårsager millioner af dødsfald årligt over hele verden. Forskere har gjort en enorm indsats for at belyse sepsis patofysiologi ved hjælp af forskellige dyremodeller; musemodellen af sepsis induceret af cecal ligering og punktering (CLP) anvendes i vid udstrækning i laboratorier. De tre tekniske aspekter, der påvirker CLP-modellens sværhedsgrad og replikabilitet, er procentdelen af cecum ligated, størrelsen af nålen, der anvendes til cecal punktering, og mængden af afføring presset ind i bukhulen. Den hurtige og specifikke diagnose af sepsis er en afgørende faktor, der påvirker resultatet. Guldstandarden for sepsisdiagnose er mikrobiel kultur; Denne proces er dog tidskrævende og undertiden unøjagtig. Påvisning af sepsisspecifikke biomarkører er hurtig, men de eksisterende biomarkører er utilfredsstillende på grund af en kort halveringstid, ikke-specificitet og utilstrækkelig følsomhed. Derfor er der et presserende behov for en pålidelig biomarkør for sepsis i de tidlige stadier. Tidligere publikationer tyder på, at overdreven neutrofil ekstracellulære fælder (NET’er) forekommer i sepsis. Citrullineret histon H3 (CitH3), som en NET-komponent, er forhøjet både hos septiske dyr og patienter, og tilstedeværelsen af CitH3 er en pålidelig diagnostisk biomarkør for sepsis. Denne undersøgelse havde til formål at beskrive en standardiseret musemodel af CLP-induceret sepsis og etablere en pålidelig blodbiomarkør for sepsis. Vores arbejde kan bidrage til den tidlige og præcise diagnose af sepsis i fremtiden.

Introduction

Sepsis er defineret som livstruende organdysfunktion forårsaget af et dysreguleret værtsrespons på infektion¹, og septisk chok er den største dødsårsag i alvorlige tilfælde af sepsis². Sepsis og septisk chok forårsager millioner af dødsfald verden over hvert år³. Nøglen til at forbedre resultatet af patienter med sepsis er hurtig initiering af behandlinger som antibiotika⁴. Guldstandardmetoden til diagnosticering af sepsis er mikrobiel kultur; Mikrobiel kultur er imidlertid tidskrævende og kan føre til falsk-positive og falsk-negative resultater, hvilket i høj grad begrænser den kliniske betydning⁵. Det er således meget ønskeligt at identificere en blodbiomarkør for sepsis. Procalcitonin er anerkendt som en ideel sepsis biomarkør, men har begrænset diagnostisk effekt, fordi det ikke er i stand til at skelne sepsis fra sterile sygdomme⁶.

Mus cecal ligering og punktering (CLP) bruges almindeligvis til at skabe en model for sepsis i videnskabelig forskning. CLP er en af de mest anvendte sepsismodeller, fordi den efterligner polymikrobiel peritonitis og aktiverer både proinflammatoriske og antiinflammatoriske immunresponser⁷. Det er godt accepteret, at CLP skaber en mere klinisk relevant sepsismodel end alternative teknikker, såsom injektion af bakterielt endotoksin. Derfor betragtes CLP som den klassiske sepsismodel til brug i forskning⁸. En stor ulempe ved CLP er imidlertid dens reproducerbarhed, da modellens sværhedsgrad påvirkes af flere faktorer, såsom procentdelen af cecum ligated, nålestørrelse, antal punkteringer og laparotomiteknik. Derfor er der behov for at standardisere den CLP-inducerede sepsismodel. Denne undersøgelse beskriver protokoldetaljerne i den CLP-inducerede sepsismodel for at vise den standardiserede procedure og øge dens reproducerbarhed.

Det inflammatoriske respons forekommer i den tidlige fase af sepsis, hvor neutrofiler frigiver for store mængder oxidanter og proteaser, der forårsager organskader⁸. En nøglefaktor i sepsisens patofysiologi er dannelsen af neutrofile ekstracellulære fælder (NET’er), som frigiver nukleare og cytosoliske komponenter såsom DNA, citrullinerede histoner og antimikrobielle proteinaser⁹. Nylige undersøgelser tyder på, at overdreven generering af NET’er formidler sepsispatologien; i mellemtiden udøver et fald i NETS gennem enzymatisk hæmning af peptidylarginin deiminase (PAD) af kemikalier som YW3-56 eller Cl-amidin en pro-overlevelseseffekt i musemodeller af sepsis^10,11. Citrullineret histon H3 (CitH3) blev identificeret som et sepsisspecifikt protein i 2011¹², og efterfølgende publikationer har vist, at den cirkulerende CitH3-koncentration er en pålidelig diagnostisk biomarkør for sepsis^13,14. CitH3 betragtes som en mere følsom og langvarig biomarkør end procalcitonin og er mere specifik til at skelne sepsis end inflammatoriske cytokiner¹³.

I denne undersøgelse har vi evalueret en pålidelig diagnostisk biomarkør for sepsis i en CLP-induceret musemodel af sepsis.

Protocol

Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med de retningslinjer, der blev godkendt af Animal Review Committee på Xiangya Hospital og Central South University (nr. 202103149). 1. Forberedelse Vælg C57BL/6J-hanmus (vægt: 20-25 g; alder: 8-12 uger) og hus i 3 dage, før der udføres procedurer. Vej musen. Anæstetiser musen med 1,5% isofluran ved indånding og klem tæerne for at kontrollere dybden af anæstesi. Fastgør musen på…

Representative Results

Som vist i figur 2A blev der ikke påvist CitH3 i skingruppen ved western blotting. Serumkoncentrationen CitH3 steg signifikant efter CLP, og denne stigning blev blokeret af inhiberingen af NET-dannelse via administration af YW3-56, en PAD-hæmmer10. Figur 2B viser serumCitH3-koncentrationerne bestemt af ELISA. Ved 24 timer efter CLP blev serumkoncentrationen af CitH3 øget i CLP-grupperne sammenlignet med skingruppen (p = 0,0008…

Discussion

CLP introducerer patogener i maven for at skabe en præklinisk model af sepsis. Ved udførelse af CLP er det vigtigt at anvende sterile forhold for at eliminere interferens fra eksogene bakterier og at anvende nøjagtige doser af anæstetika¹⁶. De tre tekniske aspekter af CLP, der påvirker sværhedsgraden og replikabiliteten af sepsismodellen, er procentdelen af cecum ligated, størrelsen af nålen, der anvendes til cecal punktering, og mængden af afføring presset ind i bukhulen. Ligering af ca…

Materials

21G needle
3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine	R&D Systems Inc	DY999
anti-CitH3 monoclonal antibody	laboratory self developed
anti-CitH3 polyclonal antibody	Abcam	ab5103
anti-rabbit secondary antibody	Jackson ImmunoResearch	111-035-003
C57BL/6 mice	Xiangya School of Medicine, Central South University
Cl-amidine	Sigma Aldrich	SML2250
depilatory cream
Dnase I	Sigma Aldrich	11284932001
isoflurane	Sigma-Aldrich	26675-46-7
ketoprofen	Sigma Aldrich	PHR1375
silk sutures (4-0 & 6-0)
surgical instruments
YW3-56	GLPBIO	GC48263