敗血症の盲腸結紮および穿刺誘発マウスモデルにおける信頼性の高いバイオマーカーの評価
Summary
このプロトコルは、敗血症のマウスモデルにおける盲腸結紮および穿刺(CLP)の手術の詳細を提示します。CLPは、敗血症の動物モデルを作成するために最も広く使用されている技術の1つです。したがって、信頼性の高い研究結果を得るためには、標準化されたCLPプロトコルが必要です。
Abstract
敗血症は、生命を脅かし、急速に発症する深刻な病気であり、世界中で毎年数百万人が死亡しています。研究者は、さまざまな動物モデルを使用して敗血症の病態生理学を解明するために多大な努力を払ってきました。盲腸結紮および穿刺(CLP)によって誘発される敗血症のマウスモデルは、実験室で広く使用されています。CLPモデルの重症度と再現性に影響を与える3つの技術的側面は、盲腸結紮の割合、盲腸穿刺に使用される針のサイズ、および腹腔内に押し込まれた糞便の量です。敗血症の迅速かつ具体的な診断は、結果に影響を与える重要な要素です。敗血症診断のゴールドスタンダードは微生物培養です。ただし、このプロセスは時間がかかり、場合によっては不正確です。敗血症特異的バイオマーカーの検出は高速ですが、既存のバイオマーカーは、半減期が短く、非特異性があり、感度が不十分なため、不十分です。したがって、初期段階での敗血症の信頼できるバイオマーカーが緊急に必要とされています。以前の出版物は、過剰な好中球細胞外トラップ(NET)が敗血症で発生することを示唆しています。NET成分としてのシトルリン化ヒストンH3(CitH3)は、敗血症動物と患者の両方で上昇しており、CitH3の存在は敗血症の信頼できる診断バイオマーカーです。本研究は、CLP誘発敗血症の標準化されたマウスモデルを記述し、敗血症の信頼できる血液バイオマーカーを確立することを目的とした。私たちの研究は、将来的に敗血症の早期かつ正確な診断に貢献する可能性があります。
Introduction
敗血症は、感染に対する調節不全の宿主反応によって引き起こされる生命を脅かす臓器機能障害として定義され1、敗血症性ショックは敗血症の重症例の主要な死因です2。敗血症と敗血症性ショックは、毎年世界中で何百万人もの死者を出しています3。敗血症患者の転帰を改善するための鍵は、抗生物質などの治療の迅速な開始です4。敗血症の診断のためのゴールドスタンダードの方法は微生物培養です。しかし、微生物培養は時間がかかり、偽陽性および偽陰性の結果につながる可能性があり、臨床的意義が大幅に制限されます5。従って、敗血症の血液バイオマーカーを同定することが極めて望ましい。プロカルシトニンは理想的な敗血症バイオマーカーとして認識されていますが、敗血症と無菌性疾患を区別できないため、診断効果は限られています6。
マウス盲腸結紮および穿刺(CLP)は、科学研究における敗血症のモデルを作成するために一般的に使用されます。CLPは、多微生物性腹膜炎を模倣し、炎症誘発性免疫応答と抗炎症性免疫応答の両方を活性化するため、最も広く使用されている敗血症モデルの1つです7。CLPは、細菌性エンドトキシンの注射などの代替技術よりも臨床的に関連性のある敗血症モデルを作成することは広く受け入れられています。したがって、CLPは、研究8で使用するための古典的な敗血症モデルと見なされます。ただし、CLPの主な欠点は、モデルの重症度が盲腸結紮の割合、針のサイズ、穿刺回数、開腹術などのいくつかの要因によって影響を受けるため、再現性です。したがって、CLP誘発敗血症モデルを標準化する必要がある。本研究では、CLP誘発敗血症モデルのプロトコルの詳細を説明し、標準化された手順を示し、その再現性を高めます。
炎症反応は敗血症の初期段階で起こり、好中球は臓器損傷を引き起こす過剰な量の酸化剤とプロテアーゼを放出します8。敗血症の病態生理における重要な要因は、DNA、シトルリン化ヒストン、抗菌プロテイナーゼなどの核および細胞質成分を放出する好中球細胞外トラップ(NET)の形成です9。最近の研究では、NETの過剰な生成が敗血症の病理を媒介することが示唆されています。一方、YW3-56やCl-アミジンなどの化学物質によるペプチジルアルギニンデイミナーゼ(PAD)の酵素的阻害によるNETの減少は、敗血症のマウスモデルで生存促進効果を発揮します10,11。シトルリン化ヒストンH3(CitH3)は2011年に敗血症特異的タンパク質として同定され12、その後の出版物は、循環CitH3濃度が敗血症の信頼できる診断バイオマーカーであることを実証している13,14。CitH3は、プロカルシトニンよりも感度が高く、長持ちするバイオマーカーと考えられており、炎症性サイトカインよりも敗血症の区別においてより特異的です13。
この研究では、敗血症のCLP誘発マウスモデルにおける敗血症の信頼できる診断バイオマーカーを評価しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
CLPは病原体を腹部に導入して敗血症の前臨床モデルを作成します。CLPを実施する際には、外因性細菌の干渉を排除し、麻酔薬の正確な投与量を使用するために無菌条件を使用することが重要です16。敗血症モデルの重症度と再現性に影響を与えるCLPの3つの技術的側面は、結紮された盲腸の割合、盲腸穿刺に使用される針のサイズ、および腹腔内に押し込まれた糞便の量です?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
実験に協力してくださったWang Wei教授とLiu Shuai博士に感謝します。この研究は、中南大学襄雅病院の若手研究資金(No.2019Q10)、湖南省国家科学基金会(No.2020JJ4902)、および中国国家自然科学基金会(No.82202394)からの助成金によって資金提供されました。
Materials
| 21G needle | |||
| 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine | R&D Systems Inc | DY999 | |
| anti-CitH3 monoclonal antibody | laboratory self developed | ||
| anti-CitH3 polyclonal antibody | Abcam | ab5103 | |
| anti-rabbit secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-035-003 | |
| C57BL/6 mice | Xiangya School of Medicine, Central South University | ||
| Cl-amidine | Sigma Aldrich | SML2250 | |
| depilatory cream | |||
| Dnase I | Sigma Aldrich | 11284932001 | |
| isoflurane | Sigma-Aldrich | 26675-46-7 | |
| ketoprofen | Sigma Aldrich | PHR1375 | |
| silk sutures (4-0 & 6-0) | |||
| surgical instruments | |||
| YW3-56 | GLPBIO | GC48263 |
Referências
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