Evaluering av en pålitelig biomarkør i en cecal ligering og punktering-indusert musemodell av sepsis

Summary

Denne protokollen presenterer de operative detaljene for cecal ligering og punktering (CLP) i en musemodell av sepsis. CLP er en av de mest brukte teknikkene for å lage en dyremodell av sepsis. Derfor er det nødvendig med en standardisert CLP-protokoll for å oppnå pålitelige forskningsresultater.

Abstract

Sepsis er en alvorlig livstruende og raskt utviklende sykdom som forårsaker millioner av dødsfall årlig over hele verden. Forskere har gjort en enorm innsats for å belyse patofysiologien til sepsis ved hjelp av ulike dyremodeller; musemodellen av sepsis indusert av cecal ligering og punktering (CLP) er mye brukt i laboratorier. De tre tekniske aspektene som påvirker alvorlighetsgraden og replikerbarheten til CLP-modellen er prosentandelen av cecum ligert, størrelsen på nålen som brukes til cecal punktering, og volumet av avføring presset inn i bukhulen. Den raske og spesifikke diagnosen sepsis er en avgjørende faktor som påvirker utfallet. Gullstandarden for sepsisdiagnose er mikrobiell kultur; Denne prosessen er imidlertid tidkrevende og noen ganger unøyaktig. Påvisning av sepsisspesifikke biomarkører er rask, men de eksisterende biomarkørene er utilfredsstillende på grunn av kort halveringstid, ikke-spesifisitet og utilstrekkelig følsomhet. Derfor er det et presserende behov for en pålitelig biomarkør for sepsis i de tidlige stadiene. Tidligere publikasjoner tyder på at overdreven nøytrofile ekstracellulære feller (NETs) forekommer i sepsis. Citrullinert histon H3 (CitH3), som en NET-komponent, er forhøyet både hos septiske dyr og pasienter, og tilstedeværelsen av CitH3 er en pålitelig diagnostisk biomarkør for sepsis. Denne studien hadde som mål å beskrive en standardisert musemodell av CLP-indusert sepsis og etablere en pålitelig blodbiomarkør for sepsis. Vårt arbeid kan bidra til tidlig og nøyaktig diagnostisering av sepsis i fremtiden.

Introduction

Sepsis er definert som livstruende organdysfunksjon forårsaket av en dysregulert vertsrespons på infeksjon¹, og septisk sjokk er den viktigste dødsårsaken ved alvorlige tilfeller av sepsis². Sepsis og septisk sjokk forårsaker millioner av dødsfall over hele verden hvert år³. Nøkkelen til å forbedre utfallet av pasienter med sepsis er rask igangsetting av behandlinger som antibiotika⁴. Gullstandardmetoden for diagnose av sepsis er mikrobiell kultur; Mikrobiell kultur er imidlertid tidkrevende og kan føre til falske positive og falske negative resultater, noe som i stor grad begrenser den kliniske betydningen⁵. Dermed er det svært ønskelig å identifisere en blodbiomarkør for sepsis. Prokalsitonin er anerkjent som en ideell sepsisbiomarkør, men har begrenset diagnostisk effekt fordi den ikke klarer å skille sepsis fra sterile sykdommer⁶.

Mus cecal ligering og punktering (CLP) brukes ofte til å lage en modell av sepsis i vitenskapelig forskning. CLP er en av de mest brukte sepsismodellene fordi den etterligner polymikrobiell peritonitt, og aktiverer både proinflammatoriske og antiinflammatoriske immunresponser⁷. Det er godt akseptert at CLP skaper en mer klinisk relevant sepsismodell enn alternative teknikker, for eksempel injeksjon av bakteriell endotoksin. CLP regnes derfor som den klassiske sepsismodellen til bruk i forskning⁸. En stor ulempe med CLP er imidlertid dens reproduserbarhet, da modellens alvorlighetsgrad påvirkes av flere faktorer som prosentandelen av cecum ligated, nålstørrelse, antall punkteringer og laparotomiteknikk. Det er derfor behov for å standardisere den CLP-induserte sepsismodellen. Denne studien beskriver protokolldetaljene i den CLP-induserte sepsismodellen for å vise den standardiserte prosedyren og øke reproduserbarheten.

Den inflammatoriske responsen oppstår i det tidlige stadiet av sepsis, med nøytrofiler som frigjør store mengder oksidanter og proteaser som forårsaker organskade⁸. En nøkkelfaktor i patofysiologien til sepsis er dannelsen av nøytrofile ekstracellulære feller (NETs), som frigjør nukleære og cytosoliske komponenter som DNA, citrullinerte histoner og antimikrobielle proteinaser⁹. Nylige studier tyder på at overdreven generering av NETs formidler patologien til sepsis; I mellomtiden utøver en reduksjon av NETs, gjennom enzymatisk inhibering av peptidylarginin deiminase (PAD) av kjemikalier som YW3-56 eller Cl-amidin, en pro-overlevelseseffekt i musemodeller av sepsis^10,11. Citrullinert histon H3 (CitH3) ble identifisert som et sepsisspesifikt protein i 2011¹², og senere publikasjoner har vist at den sirkulerende CitH3-konsentrasjonen er en pålitelig diagnostisk biomarkør for sepsis^13,14. CitH3 regnes som en mer sensitiv og langvarig biomarkør enn prokalsitonin, og er mer spesifikk i å skille sepsis enn inflammatoriske cytokiner¹³.

I denne studien har vi evaluert en pålitelig diagnostisk biomarkør for sepsis i en CLP-indusert musemodell av sepsis.

Protocol

Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med retningslinjene godkjent av Animal Review Committee ved Xiangya Hospital og Central South University (nr. 202103149). 1. Forberedelse Velg mannlige C57BL/6J mus (vekt: 20-25 g; alder: 8-12 uker) og hus i 3 dager før du utfører noen prosedyrer. Vei musen. Bedøv musen med 1,5% isofluran ved innånding og klem tærne for å sjekke anestesidybden. Fest musen på varmeputen. Påfør hårfjerningsk…

Representative Results

Som vist i figur 2A, ble det ikke påvist CitH3 i humbuggruppen ved vestlig blotting. Serumkonsentrasjonen av CitH3 økte signifikant etter CLP, og denne økningen ble blokkert av hemming av NET-dannelse via administrering av YW3-56, en PAD-hemmer10. Figur 2B viser serumCitH3-konsentrasjonene bestemt av ELISA. Ved 24 timer etter CLP var serumkonsentrasjonen av CitH3 økt i CLP-gruppene sammenlignet med humbuggruppen (p = 0,0008),…

Discussion

CLP introduserer patogener i magen for å skape en preklinisk modell av sepsis. Når du utfører CLP, er det viktig å bruke sterile forhold for å eliminere interferens av eksogene bakterier og å bruke nøyaktige doser av anestetika¹⁶. De tre tekniske aspektene ved CLP som påvirker alvorlighetsgraden og replikerbarheten til sepsismodellen, er prosentandelen av cecum ligated, størrelsen på nålen som brukes til cecal punktering, og volumet av avføring presset inn i bukhulen. Ligering av ca 75…

Materials

21G needle
3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine	R&D Systems Inc	DY999
anti-CitH3 monoclonal antibody	laboratory self developed
anti-CitH3 polyclonal antibody	Abcam	ab5103
anti-rabbit secondary antibody	Jackson ImmunoResearch	111-035-003
C57BL/6 mice	Xiangya School of Medicine, Central South University
Cl-amidine	Sigma Aldrich	SML2250
depilatory cream
Dnase I	Sigma Aldrich	11284932001
isoflurane	Sigma-Aldrich	26675-46-7
ketoprofen	Sigma Aldrich	PHR1375
silk sutures (4-0 & 6-0)
surgical instruments
YW3-56	GLPBIO	GC48263