Denne protokol præsenterer de operative detaljer om cecal ligering og punktering (CLP) i en musemodel af sepsis. CLP er en af de mest anvendte teknikker til at skabe en dyremodel af sepsis. Derfor kræves en standardiseret CLP-protokol for at opnå pålidelige forskningsresultater.
Sepsis er en alvorlig livstruende og hurtigt udviklende sygdom, der forårsager millioner af dødsfald årligt over hele verden. Forskere har gjort en enorm indsats for at belyse sepsis patofysiologi ved hjælp af forskellige dyremodeller; musemodellen af sepsis induceret af cecal ligering og punktering (CLP) anvendes i vid udstrækning i laboratorier. De tre tekniske aspekter, der påvirker CLP-modellens sværhedsgrad og replikabilitet, er procentdelen af cecum ligated, størrelsen af nålen, der anvendes til cecal punktering, og mængden af afføring presset ind i bukhulen. Den hurtige og specifikke diagnose af sepsis er en afgørende faktor, der påvirker resultatet. Guldstandarden for sepsisdiagnose er mikrobiel kultur; Denne proces er dog tidskrævende og undertiden unøjagtig. Påvisning af sepsisspecifikke biomarkører er hurtig, men de eksisterende biomarkører er utilfredsstillende på grund af en kort halveringstid, ikke-specificitet og utilstrækkelig følsomhed. Derfor er der et presserende behov for en pålidelig biomarkør for sepsis i de tidlige stadier. Tidligere publikationer tyder på, at overdreven neutrofil ekstracellulære fælder (NET’er) forekommer i sepsis. Citrullineret histon H3 (CitH3), som en NET-komponent, er forhøjet både hos septiske dyr og patienter, og tilstedeværelsen af CitH3 er en pålidelig diagnostisk biomarkør for sepsis. Denne undersøgelse havde til formål at beskrive en standardiseret musemodel af CLP-induceret sepsis og etablere en pålidelig blodbiomarkør for sepsis. Vores arbejde kan bidrage til den tidlige og præcise diagnose af sepsis i fremtiden.
Sepsis er defineret som livstruende organdysfunktion forårsaget af et dysreguleret værtsrespons på infektion1, og septisk chok er den største dødsårsag i alvorlige tilfælde af sepsis2. Sepsis og septisk chok forårsager millioner af dødsfald verden over hvert år3. Nøglen til at forbedre resultatet af patienter med sepsis er hurtig initiering af behandlinger som antibiotika4. Guldstandardmetoden til diagnosticering af sepsis er mikrobiel kultur; Mikrobiel kultur er imidlertid tidskrævende og kan føre til falsk-positive og falsk-negative resultater, hvilket i høj grad begrænser den kliniske betydning5. Det er således meget ønskeligt at identificere en blodbiomarkør for sepsis. Procalcitonin er anerkendt som en ideel sepsis biomarkør, men har begrænset diagnostisk effekt, fordi det ikke er i stand til at skelne sepsis fra sterile sygdomme6.
Mus cecal ligering og punktering (CLP) bruges almindeligvis til at skabe en model for sepsis i videnskabelig forskning. CLP er en af de mest anvendte sepsismodeller, fordi den efterligner polymikrobiel peritonitis og aktiverer både proinflammatoriske og antiinflammatoriske immunresponser7. Det er godt accepteret, at CLP skaber en mere klinisk relevant sepsismodel end alternative teknikker, såsom injektion af bakterielt endotoksin. Derfor betragtes CLP som den klassiske sepsismodel til brug i forskning8. En stor ulempe ved CLP er imidlertid dens reproducerbarhed, da modellens sværhedsgrad påvirkes af flere faktorer, såsom procentdelen af cecum ligated, nålestørrelse, antal punkteringer og laparotomiteknik. Derfor er der behov for at standardisere den CLP-inducerede sepsismodel. Denne undersøgelse beskriver protokoldetaljerne i den CLP-inducerede sepsismodel for at vise den standardiserede procedure og øge dens reproducerbarhed.
Det inflammatoriske respons forekommer i den tidlige fase af sepsis, hvor neutrofiler frigiver for store mængder oxidanter og proteaser, der forårsager organskader8. En nøglefaktor i sepsisens patofysiologi er dannelsen af neutrofile ekstracellulære fælder (NET’er), som frigiver nukleare og cytosoliske komponenter såsom DNA, citrullinerede histoner og antimikrobielle proteinaser9. Nylige undersøgelser tyder på, at overdreven generering af NET’er formidler sepsispatologien; i mellemtiden udøver et fald i NETS gennem enzymatisk hæmning af peptidylarginin deiminase (PAD) af kemikalier som YW3-56 eller Cl-amidin en pro-overlevelseseffekt i musemodeller af sepsis10,11. Citrullineret histon H3 (CitH3) blev identificeret som et sepsisspecifikt protein i 201112, og efterfølgende publikationer har vist, at den cirkulerende CitH3-koncentration er en pålidelig diagnostisk biomarkør for sepsis13,14. CitH3 betragtes som en mere følsom og langvarig biomarkør end procalcitonin og er mere specifik til at skelne sepsis end inflammatoriske cytokiner13.
I denne undersøgelse har vi evalueret en pålidelig diagnostisk biomarkør for sepsis i en CLP-induceret musemodel af sepsis.
CLP introducerer patogener i maven for at skabe en præklinisk model af sepsis. Ved udførelse af CLP er det vigtigt at anvende sterile forhold for at eliminere interferens fra eksogene bakterier og at anvende nøjagtige doser af anæstetika16. De tre tekniske aspekter af CLP, der påvirker sværhedsgraden og replikabiliteten af sepsismodellen, er procentdelen af cecum ligated, størrelsen af nålen, der anvendes til cecal punktering, og mængden af afføring presset ind i bukhulen. Ligering af ca…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker professor Wang Wei og doktor Liu Shuai for at hjælpe med eksperimenterne. Dette arbejde blev finansieret af tilskud fra Young Research Funding of Xiangya Hospital, Central South University (nr. 2019Q10), fra National and Science Foundation of Hunan Province (nr. 2020JJ4902) og fra National Natural Science Foundation of China (nr. 82202394).
21G needle | |||
3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine | R&D Systems Inc | DY999 | |
anti-CitH3 monoclonal antibody | laboratory self developed | ||
anti-CitH3 polyclonal antibody | Abcam | ab5103 | |
anti-rabbit secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-035-003 | |
C57BL/6 mice | Xiangya School of Medicine, Central South University | ||
Cl-amidine | Sigma Aldrich | SML2250 | |
depilatory cream | |||
Dnase I | Sigma Aldrich | 11284932001 | |
isoflurane | Sigma-Aldrich | 26675-46-7 | |
ketoprofen | Sigma Aldrich | PHR1375 | |
silk sutures (4-0 & 6-0) | |||
surgical instruments | |||
YW3-56 | GLPBIO | GC48263 |