Valutazione di un biomarcatore affidabile in un modello murino di sepsi indotta da legatura cecale e puntura
Summary
Questo protocollo presenta i dettagli operativi della legatura e puntura cecale (CLP) in un modello murino di sepsi. Il CLP è una delle tecniche più utilizzate per creare un modello animale di sepsi. Pertanto, è necessario un protocollo CLP standardizzato per il raggiungimento di risultati di ricerca affidabili.
Abstract
La sepsi è una grave malattia pericolosa per la vita e in rapido sviluppo che causa milioni di morti ogni anno in tutto il mondo. I ricercatori hanno compiuto enormi sforzi per chiarire la fisiopatologia della sepsi utilizzando vari modelli animali; il modello murino di sepsi indotta dalla legatura e puntura cecale (CLP) è ampiamente utilizzato nei laboratori. I tre aspetti tecnici che influenzano la gravità e la replicabilità del modello CLP sono la percentuale di cieco legato, la dimensione dell’ago utilizzato per la puntura cecale e il volume di feci schiacciate nella cavità addominale. La diagnosi rapida e specifica della sepsi è un fattore cruciale che influenza l’esito. Il gold standard per la diagnosi della sepsi è la coltura microbica; Tuttavia, questo processo richiede molto tempo e talvolta è impreciso. La rilevazione di biomarcatori specifici per la sepsi è rapida, ma i biomarcatori esistenti sono insoddisfacenti a causa di una breve emivita, non specificità e sensibilità insufficiente. Pertanto, vi è un urgente bisogno di un biomarcatore affidabile di sepsi nelle fasi iniziali. Pubblicazioni precedenti suggeriscono che eccessive trappole extracellulari dei neutrofili (NET) si verificano nella sepsi. L’istone citrullinato H3 (CitH3), come componente NET, è elevato sia negli animali settici che nei pazienti e la presenza di CitH3 è un biomarcatore diagnostico affidabile della sepsi. Il presente studio mirava a descrivere un modello murino standardizzato di sepsi indotta da CLP e stabilire un biomarcatore ematico affidabile della sepsi. Il nostro lavoro può contribuire alla diagnosi precoce e accurata della sepsi in futuro.
Introduction
La sepsi è definita come una disfunzione d’organo pericolosa per la vita causata da una risposta disregolata dell’ospite all’infezione1 e lo shock settico è la principale causa di morte nei casi gravi di sepsi2. La sepsi e lo shock settico causano milioni di morti in tutto il mondo ogni anno3. La chiave per migliorare l’esito dei pazienti con sepsi è l’inizio tempestivo di trattamenti come gli antibiotici4. Il metodo gold standard per la diagnosi di sepsi è la coltura microbica; Tuttavia, la coltura microbica richiede molto tempo e può portare a risultati falsi positivi e falsi negativi, che limitano notevolmente il significato clinico5. Pertanto, è altamente desiderabile identificare un biomarcatore del sangue della sepsi. La procalcitonina è riconosciuta come un biomarcatore ideale per la sepsi, ma ha un’efficacia diagnostica limitata perché non è in grado di distinguere la sepsi dalle malattie sterili6.
La legatura e puntura cecale del topo (CLP) è comunemente usata per creare un modello di sepsi nella ricerca scientifica. Il CLP è uno dei modelli di sepsi più utilizzati perché imita la peritonite polimicrobica, attivando risposte immunitarie sia proinfiammatorie che antinfiammatorie7. È ben noto che il CLP crea un modello di sepsi clinicamente più rilevante rispetto a tecniche alternative, come l’iniezione di endotossina batterica. Pertanto, il CLP è considerato il modello classico di sepsi da utilizzare nella ricerca8. Tuttavia, uno dei principali svantaggi del CLP è la sua riproducibilità, poiché la gravità del modello è influenzata da diversi fattori come la percentuale di cieco legato, la dimensione dell’ago, il numero di punture e la tecnica di laparotomia. Pertanto, è necessario standardizzare il modello di sepsi indotta da CLP. Il presente studio descrive i dettagli del protocollo del modello di sepsi indotta da CLP per mostrare la procedura standardizzata e aumentarne la riproducibilità.
La risposta infiammatoria si verifica nella fase iniziale della sepsi, con i neutrofili che rilasciano quantità eccessive di ossidanti e proteasi che causano danni agli organi8. Un fattore chiave nella fisiopatologia della sepsi è la formazione di trappole extracellulari per neutrofili (NET), che rilasciano componenti nucleari e citosolici come DNA, istoni citrullinati e proteinasi antimicrobiche9. Studi recenti suggeriscono che l’eccessiva generazione di NET media la patologia della sepsi; nel frattempo, una diminuzione dei NET, attraverso l’inibizione enzimatica della peptidil arginina deiminasi (PAD) da parte di sostanze chimiche come YW3-56 o Cl-amidina, esercita un effetto pro-sopravvivenza nei modelli murini di sepsi10,11. L’istone citrullinato H3 (CitH3) è stato identificato come proteina specifica per la sepsi nel 201112, e successive pubblicazioni hanno dimostrato che la concentrazione circolante di CitH3 è un biomarcatore diagnostico affidabile della sepsi13,14. CitH3 è considerato un biomarcatore più sensibile e duraturo della procalcitonina ed è più specifico nel distinguere la sepsi rispetto alle citochine infiammatorie13.
In questo studio, abbiamo valutato un biomarcatore diagnostico affidabile della sepsi in un modello murino di sepsi indotto da CLP.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il CLP introduce agenti patogeni nell’addome per creare un modello preclinico di sepsi. Quando si esegue il CLP, è importante utilizzare condizioni sterili per eliminare l’interferenza dei batteri esogeni e utilizzare dosaggi accurati di anestetici16. I tre aspetti tecnici del CLP che influenzano la gravità e la replicabilità del modello di sepsi sono la percentuale del cieco legato, la dimensione dell’ago utilizzato per la puntura cecale e il volume di feci schiacciate nella cavità addominale…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il professor Wang Wei e il dottor Liu Shuai per l’aiuto negli esperimenti. Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni del Young Research Funding of Xiangya Hospital, Central South University (n. 2019Q10), dalla National and Science Foundation della provincia di Hunan (n. 2020JJ4902) e dalla National Natural Science Foundation of China (n. 82202394).
Materials
| 21G needle | |||
| 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine | R&D Systems Inc | DY999 | |
| anti-CitH3 monoclonal antibody | laboratory self developed | ||
| anti-CitH3 polyclonal antibody | Abcam | ab5103 | |
| anti-rabbit secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-035-003 | |
| C57BL/6 mice | Xiangya School of Medicine, Central South University | ||
| Cl-amidine | Sigma Aldrich | SML2250 | |
| depilatory cream | |||
| Dnase I | Sigma Aldrich | 11284932001 | |
| isoflurane | Sigma-Aldrich | 26675-46-7 | |
| ketoprofen | Sigma Aldrich | PHR1375 | |
| silk sutures (4-0 & 6-0) | |||
| surgical instruments | |||
| YW3-56 | GLPBIO | GC48263 |
Referências
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