山羊窒息关节髌下脂肪垫间充质干细胞的分离、扩增和分化

Summary

髌下脂肪垫间充质干细胞（IFP-MSCs）可以很容易地从膝关节的髌下脂肪垫中分离出来。它们 在体外增殖良好，形成CFU-F集落，并分化为成脂、软骨和成骨谱系。本文提供了从山羊扼杀关节分离、扩增和分化IFP-MSCs的方法。

Abstract

存在于膝关节中的IFP是MSC的有希望的来源。IFP是一种易于接近的组织，因为它在关节镜手术和膝关节置换手术中被常规切除和丢弃。此外，其移除与最低供体部位发病率相关。最近的研究表明，IFP-MSCs在 体外 扩增过程中不会失去其增殖能力，并且具有与年龄无关的成骨分化潜力。与骨髓来源的MSC（BMSC）和脂肪来源的干细胞（ADSC）相比，IFP-MSCs具有优越的软骨分化潜力。虽然这些细胞很容易从老年和患病患者中获得，但它们的有效性是有限的。因此，使用来自健康供体的IFP-MSCs对于确定其在生物医学应用中的功效非常重要。由于获得健康的人类供体具有挑战性，动物模型可能是实现基本理解的更好选择。狗、马、绵羊和山羊等大型动物在转化研究中起着至关重要的作用。其中，山羊可能是首选模型，因为山羊的窒息关节与人类膝关节的解剖结构最接近。此外，山羊IFP可以满足组织再生应用所需的更高MSC数。此外，低成本、可用性和符合动物研究的 3R 原则使其成为一个有吸引力的模型。本研究展示了一种简单的方案，用于从山羊的扼杀关节和 体外 培养条件下分离IFP-MSCs，以实现其扩增和分化。从山羊中无菌分离的IFP被洗涤，切碎并酶消化。过滤和离心后，将收集的细胞培养。这些细胞是贴壁的，具有MSCs样形态，并显示出显着的克隆生成能力。此外，它们分化为成脂肪、软骨和成骨谱系，证明了它们的多能性。总之，该研究证明了间充质干细胞的分离和扩增，显示出在组织工程和再生医学应用中的潜力。

Introduction

间充质干细胞（MSCs）是再生医学中基于细胞的疗法的有吸引力的候选者^1，2。它们可以从各种组织来源中收获，例如骨髓、脐带、胎盘、牙髓和皮下脂肪组织³.然而，由于成人干细胞的可用性有限，并且它们的分离程序通常是侵入性的（导致供体部位的发病率），因此希望有一种替代的干细胞来源来规避这些挑战。

膝关节是各种细胞类型的储存库，如髌下脂肪垫衍生的MSC，滑膜来源的MSC，滑液来源的MSC，韧带成纤维细胞，关节软骨细胞等4，^5，6。这些细胞有可能在基于肌肉骨骼组织工程的研究中得到广泛探索。因此，膝关节可能是多种类型间充质干细胞的可能和可靠来源。 位于膝关节的脂肪库，称为髌下脂肪垫（IFP）或霍法脂肪垫，是MSC储存库的有前途的替代选择。IFP是一种相对容易获得和临床上可获得的MSCs来源，因为它在膝关节镜检查或开放膝关节手术中被常规切除并作为手术废物丢弃。去除IFP与最低供体部位发病率相关，这也使其成为一种有吸引力的组织来源。虽然具有相似的表型特征，但与骨髓来源的间充质干细胞（BM-MSCs）6相比，IFP（IFP-MSCs）的MSCs具有增强的克隆生成潜力，与皮下脂肪来源干细胞（ADSC^）相比，具有更好的增殖^能力7。有趣的是，与滑液衍生的MSC（SF-MSCs）相比，IFP-MSCs在晚期传代时不会失去其增殖能力，在晚期传代时也不会增加倍增时间。这表明，在细胞扩增过程中，IFP-MSCs可以实现足够多的细胞用于体外组织工程应用，而不会影响其增殖速率⁸。最近的研究还表明，与骨髓来源的MSC（BMSC）和脂肪来源的MSC（ADSC）相比，IFP-MSCs具有优越的软骨分化潜力，这可能是因为它们在解剖学上接近关节软骨，表明它们适用于软骨组织工程⁶，⁷，^9，10。此外，它们还具有与年龄无关的成骨分化潜力¹¹。关节内注射IFP-MSC已被证明可以减轻骨关节炎（OA）患者的疼痛并改善膝关节功能^12，13。此外，还报道了在病理条件下存在炎性细胞因子的情况下IFP-MSCs的强免疫抑制反应和改善的免疫调节特性⁶。

IFP-MSCs是MSCs的一个有前途的替代来源;然而，它们在组织工程和再生医学中的治疗益处相对较少被探索。现有的IFP-MSCs研究主要利用了来自人类供体的细胞。其中，最近的一些研究调查了来自健康人类供体（非关节炎患者，年龄在17-60岁）的IFP-MSCs6，^14，而大多数研究使用了来自接受全膝关节置换手术的老年患者（患病患者^，年龄70-80岁）的IFP-MSC。由于已知年龄和疾病都会改变干细胞的正常功能（数量减少和功能潜力丧失），这可能导致基于MSC的研究结果不一致⁷，^15，16，17。除此之外，来自病理生理状况（例如关节炎和肥胖症）患者的IFP-MSC的使用也给体外理解健康细胞的基本特征带来了困难，从而成为基于MSCs的疗法开发的限制因素。为了克服这些问题，使用来自健康供体的IFP-MSC至关重要。由于获得健康的人类供体具有挑战性，动物模型可能是更好的选择。在这方面，有一些研究已经从小鼠^中分离出IFP18。然而，由于正常小鼠脂肪垫的尺寸很小，来自多种动物的脂肪组织已经结合以获得足够的组织来执行复杂的实验程序¹⁹。因此，需要一个大型动物模型，它可以满足对更多细胞的要求，同时符合动物研究中的3R原则（精制，替换和减少）²⁰。大型动物的使用在转化研究中具有重要意义。具体来说，在肌肉骨骼组织工程中，已经研究了一系列大型动物，如狗，猪，绵羊，山羊和马²¹。山羊（Capra aegagrus hircus）是大型动物的绝佳选择，因为它的窒息关节与人类膝关节的解剖结构最接近²²，^23，24。山羊的软骨下骨小梁结构和软骨下骨厚度与人类相似，据报道软骨与骨骼的比例也接近人类²¹。此外，山羊在世界各地被广泛驯化，使它们在骨骼成熟时很容易获得。此外，低维护成本和易于操作使它们成为有吸引力的研究动物模型²²。

在本研究中，展示了一种简单的方案，用于从山 羊（山 羊）的扼杀关节中分离IFP-MSCs，以及用于其扩增和分化的 体外 培养条件。分离的细胞是贴壁的，具有MSC样形态，形成CFU-F（集落形成单位成纤维细胞）集落，并具有脂肪，软骨和成骨分化潜力。因此，IFP-MSCs显示出作为生物医学应用MSCs替代来源的潜力。

Protocol

该协议基于从山羊中分离IFP-MSC。山羊IFP和血液是从当地的屠宰场收集的。由于此类组织收集不属于机构动物伦理委员会的职权范围，因此不需要伦理批准。 1. IFP-MSCs与山羊膝关节股骨关节的分离 收集山羊股骨关节（样本），包括后肢的股骨和胫骨区域各~15厘米。立即将样品放入无菌样品收集盒中，并将其储存在4°C，以便运输到实验室进行进一步处理。在…

Representative Results

从山羊股骨关节中分离IFP-MSCs的将IFP-MSCs与山羊的窒息关节分离所涉及的步骤如图 1所示。去除髌骨内非关节表面的脂肪垫，切碎并酶消化。成功分离IFP-MSCs并在 体外 培养（图2A）。 IFP-MSCs的扩增和克隆生成能力分离的细胞在扩增培养基中体 外 培养。细胞在接种后12小时内开始粘附在组?…

Discussion

在本协议中，提供了一种简单、可靠且可重现的从山羊IFP中分离MSCs的方法。使用这种方法分离的细胞已成功用于我们以前的体外组织再生研究。观察到分离的细胞是增殖的，对各种生长因子有反应，并且在接种在静电纺丝纤维和支架上时保持其生物活性^25，26。此外，观察到可以获得大量高质量的MSCs并与可注射水凝胶中的软骨细胞共培养，以在<e…

Materials

β-glycerophosphate	Sigma-Aldrich	G9422-10G	10 mM
0.25% Trypsin- 0.02% EDTA	Hi-Media	TCL049
15-mL centrifuge tube	Corning
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt	Sigma	49752-10G	50 µg/mL
2-Propanol	Sigma-Aldrich	I9516
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	HiMedia	TCL021-50ml	10 mM
50-mL centrifuge tube	Corning
Alcian Blue	Hi-Media	RM471	For sufated gycosaminoglycans staining
Alizarin Red S	S D Fine-Chem Limited	26048-25G	For calcium deposition
Amphotericin B	HiMedia	A011	2.5 µg/mL
Basic fibroblast growth factor (bFGF)	Sino Biologicals	10014-HNAE	5 ng/mL
BCIP/NBT ALP Substrate	Sigma	B5655-5TAB	For ALP staining
Biological safety cabinet
BSA	HiMedia	MB-083	Long name: Bovine Serum Albumin (1.25 mg/mL )
Cell strainer	HiMedia	TCP-182	70 µm
Centrifuge	REMI
Ciprofloxacin	RANBAXY LAB. Limited	B17407T1	2.5 µg/mL
Crystal Violet	S D Fine-Chem Limited	42555
D(+)-glucose	Merck	1.94925.0521	25 mM
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D2915	1 µM
DMEM LG	SIGMA	D5523	Long name: Dulbecco’s Modified Eagle’s Media Low Glucose
Ethanol	Merck	100983
FBS	Gibco	10270	Long name: Fetal Bovine Serum
Formaldehyde solution 37%-41%	Merck	61780805001730
Indomethacin	Sigma-Aldrich	I7378	100 µM
Insulin	Sigma-Aldrich	I9278	10 µg/mL
Inverted microscope	Nikon Eclipse TS 100
ITS + 1	Sigma-Aldrich	I2521-5mL	Long name: insulin, transferrin, sodium selenite + linoleic-BSA
L-Proline	HiMedia	TO-109-25G	1 mM
Magnesium chloride	Merck	61751605001730	For lysis buffer
Methanol	Meck	1.07018.2521
Micropipettes and sterile tips (20 µL, 200 µL, 1000 µL)	Thermoscientific
MUSE Cell analyser	Merck Millipore		For cell counting
OCT compound	Tissue-Tek	4583	Long name: Optimal Cutting Temperature
Oil Red O dye	S D Fine-Chem Limited	54304	For lipid vacuole staining
Penicillin-Streptomycin	HiMedia	A007	100 U/mL
Petri dishes (150 mm and 90 mm)	NEST
Safranin O	S D Fine-Chem Limited	50240	For sufated gycosaminoglycans staining
Sodium citrate	Sigma-Aldrich	C3434	3.4 % (w/v)
Sterile scissors, forceps and scalpels			For isolation of IFP-MSC
Sucrose	Merck	1.94953.0521	35 % (w/v)
TGF-β1	Sino Biologicals		Long name: Transforming growth factor- β1 (10 ng/mL)
Tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2	Thermoscientific
Tris buffer	Merck	61771405001730	For lysis buffer
Triton X100	S D Fine-Chem Limited	40632	For lysis buffer
Type II collagenase	Gibco	17101015	1.5 mg/mL
Vitamin D3	Sigma	C9756-1G	10 nM
Well plates (6 -WP and 24-WP)	NEST