ヤギ窒息関節の膝蓋下脂肪パッドからの間葉系幹細胞の単離、増殖、および分化

Summary

膝下脂肪パッド間葉系幹細胞(IFP-MSC)は、膝関節の膝蓋下脂肪パッドから容易に単離することができる。それらは in vitroでよく増殖し、CFU-Fコロニーを形成し、脂肪原性、軟骨形成性、および骨形成系統に分化します。本明細書では、IFP-MSCsをヤギ窒息関節から単離、拡大、および分化するための方法論が提供される。

Abstract

膝関節に存在するIFPは、MSCの有望な供給源として機能します。IFPは、関節鏡手術や膝関節置換術中に日常的に切除および廃棄されるため、簡単にアクセスできる組織です。さらに、その除去は、最小限のドナー部位の罹患率に関連しています。最近の研究では、IFP-MSCは in vitro 拡張中に増殖能力を失わず、年齢に依存しない骨形成分化の可能性を有することが実証されています。IFP-MSCは、骨髄由来MSC(BMSC)や脂肪由来幹細胞(ADSC)と比較して、優れた軟骨形成分化能を有する。これらの細胞は高齢患者や罹患患者から容易に入手できるが、その有効性は限られている。したがって、健康なドナーからのIFP-MSCを使用することは、生物医学的用途におけるそれらの有効性を決定するために重要です。健康な人間のドナーへのアクセスは困難であるため、動物モデルは基本的な理解を可能にするためのより良い代替手段になる可能性があります。犬、馬、羊、山羊などの大型動物は、トランスレーショナルリサーチにおいて重要な役割を果たします。これらの中で、ヤギの窒息関節は人間の膝関節に最も近い解剖学的構造を持っているので、ヤギが好ましいモデルである可能性があります。さらに、ヤギIFPは、組織再生アプリケーションに必要なより高いMSC数を満たすことができます。さらに、低コスト、入手可能性、および動物研究の3R原則への準拠により、魅力的なモデルになっています。この研究は、IFP-MSCをヤギの窒息関節から分離するための簡単なプロトコルと、それらの増殖と分化のための in vitro 培養条件を示しています。ヤギから無菌的に単離されたIFPを洗浄し、ミンチし、酵素的に消化した。濾過及び遠心分離後、回収した菌体を培養した。これらの細胞は接着性であり、MSCs様形態を有し、顕著なクローン形成能を示した。さらに、それらは脂肪原性、軟骨形成性、および骨形成系の系統に分化し、それらの多能性を示しました。結論として、この研究は、組織工学および再生医療の応用に可能性を示すMSCの分離と拡大を示しています。

Introduction

間葉系幹細胞(MSC)は、再生医療における細胞ベースの治療の魅力的な候補です^1,2。それらは、骨髄、臍帯、胎盤、歯髄、皮下脂肪組織などのさまざまな組織源から採取できます³。ただし、成人における幹細胞の利用可能性は限られており、それらの単離手順はしばしば侵襲的である(ドナー部位の罹患率をもたらす)ため、これらの課題を回避できる代替幹細胞源を有することが望ましい。

膝関節は、乳膝下脂肪パッド由来MSC、滑膜由来MSC、滑液由来MSC、靭帯線維芽細胞、関節軟骨細胞など、様々な細胞型のデポーである^4,5,6。これらの細胞は、筋骨格系組織工学に基づく研究で広く探求される可能性があります。したがって、膝関節は、複数のタイプのMSCの可能で信頼できる供給源になる可能性があります。 膝関節にある脂肪デポは、膝蓋下脂肪パッド(IFP)またはホファ脂肪パッドとして知られており、MSCデポの有望で代替的な選択肢です。IFPは、膝関節鏡検査または膝関節手術中に外科的廃棄物として日常的に切除および廃棄されるため、比較的簡単にアクセスでき、臨床的に入手可能なMSCの供給源です。IFPの除去は、ドナー部位の罹患率が最小限に抑えられることと関連しており、これも魅力的な組織源となる。IFP由来のMSC(IFP-MSC^)は、同様の表現型プロファイルを持ちながら、骨髄由来間葉系幹細胞(BM-MSC)6と比較してクローン形成能を高め、皮下脂肪由来幹細胞(ADSC)と比較して増殖能が優れています⁷。興味深いことに、滑液由来MSC(SF-MSC)と比較して、IFP-MSCは継代が遅くても増殖能力を失うことはなく、継代が遅くなっても倍増時間が長くなることはありません。これは、IFP-MSCが細胞増殖中に、増殖速度を損なうことなく、in vitro組織工学アプリケーションのために十分に多数の細胞を達成できることを示唆^{しています8}。最近の研究では、IFP-MSCは骨髄由来MSC(BMSC)や脂肪由来MSC(ADSC)と比較して優れた軟骨分化能を有することが示唆されており、おそらく解剖学的に関節軟骨に近接しているためであり、軟骨組織工学への適合性を示しています^6,7,9,10。さらに、それらは年齢に依存しない骨形成分化能も持っています¹¹。IFP-MSCの関節内注射は、変形性関節症(OA)患者の疼痛を軽減し、膝関節機能を改善することが示されています^12,13。さらに、病的状態における炎症性サイトカインの存在下でのIFP-MSCの強力な免疫抑制応答および改善された免疫調節特性も報告されています⁶。

IFP-MSCは、MSCの有望で代替的な供給源です。しかし、組織工学や再生医療におけるそれらの治療上の利点は比較的探求されていません。IFP-MSCに関する既存の研究では、主にヒトドナーからの細胞が利用されています。これらのうち、最近のいくつかの研究では、健康なヒトドナー(非関節炎患者、17〜60歳)からのIFP-MSCを調査していますが^6,14、ほとんどの研究では、人工膝関節全置換術を受けている高齢患者(罹患患者、70〜80歳)のIFP-MSCを使用しています。年齢と疾患の両方が幹細胞の正常な機能を変化させることが知られているため(数の減少と機能電位の喪失)、これはMSCベースの研究の結果に矛盾をもたらす可能性があります7,15,16,17。それに加えて、病態生理学的状態(関節炎や肥満など)の患者からのIFP-MSCの使用は、in vitroで健康な細胞の基本的な特性を理解することも困難であり、それによってMSCベースの治療法の開発における制限因子として機能します。これらの問題を克服するためには、健康なドナーからのIFP-MSCの使用が不可欠です。健康な人間のドナーへのアクセスは困難であるため、動物モデルはより良い代替手段になる可能性があります。これに関して、IFPがマウスから単離されたいくつかの研究がある¹⁸。しかし、通常のマウスでは脂肪パッドのサイズが小さいため、複数の動物の脂肪組織が組み合わされて、精巧な実験手順を実行するのに十分な組織が得られています¹⁹。したがって、より多くの細胞の要件を満たすと同時に、動物研究における3Rの原則(精製、置換、および削減)に準拠することができる大型動物モデルが必要です²⁰。大型動物の使用は、トランスレーショナルリサーチにおいて重要な意味を持ちます。具体的には、筋骨格組織工学において、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマなどの様々な大型動物が調査されている²¹。ヤギ(Capra aegagrus hircus)は、その窒息関節が人間の膝関節に最も近い解剖学的構造を持っているため、大型動物の優れた選択肢です22,23,24。ヤギの軟骨下骨梁構造と軟骨下骨の厚さはヒトと類似しており、骨に対する軟骨の割合もヒトに近いと報告されています²¹。さらに、ヤギは世界中で広く家畜化されており、骨格的に成熟しているときに簡単に入手できるようになりました。さらに、メンテナンスコストが低く、取り扱いが容易なため、研究にとって魅力的な動物モデルとなっています²²。

本研究では、IFP-MSCを Capra aegagrus hircus (ヤギ)の窒息関節から単離するための簡単なプロトコルと、それらの増殖と分化のための in vitro 培養条件が実証されています。単離された細胞は接着性であり、MSC様形態を有し、CFU-F(コロニー形成単位-線維芽細胞)コロニーを形成し、脂肪原性、軟骨形成性、および骨形成分化能を有する。したがって、IFP-MSCは、生物医学的用途のためのMSCの代替供給源としての可能性を示しています。

Protocol

このプロトコルは、ヤギからのIFP-MSCの分離に基づいています。ヤギのIFPと血液は地元の食肉処理場から採取されました。このような組織採取は施設動物倫理委員会の範囲外であるため、倫理的承認は必要ありませんでした。 1.ヤギ膝の大腿脛関節からのIFP-MSCの分離 後肢の大腿骨領域と脛骨領域のそれぞれ~15 cmを含むヤギの大腿脛関節(サンプル)を収?…

Representative Results

ヤギの大腿脛骨関節からのIFP-MSCの分離ヤギの窒息関節からのIFP-MSCの分離に関連するステップを 図1に示します。膝蓋骨の内側の非関節表面に存在する脂肪パッドを取り外し、細かく刻み、酵素的に消化した。IFP-MSCは、 インビトロで 単離および培養に成功しました(図2A)。 IFP-MSCの増殖とクローン形…

Discussion

本プロトコルでは、ヤギIFPからMSCを単離するための簡単で信頼性が高く、再現性のある方法が提供されています。この方法を使用して単離された細胞は、in vitro組織再生のための以前の研究で成功裏に使用されています。単離された細胞は増殖性であり、様々な成長因子に応答し、電界紡糸繊維および足場に播種したときにそれらの生物学的活性を保持することが観察された<sup class="xr…

Materials

β-glycerophosphate	Sigma-Aldrich	G9422-10G	10 mM
0.25% Trypsin- 0.02% EDTA	Hi-Media	TCL049
15-mL centrifuge tube	Corning
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt	Sigma	49752-10G	50 µg/mL
2-Propanol	Sigma-Aldrich	I9516
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	HiMedia	TCL021-50ml	10 mM
50-mL centrifuge tube	Corning
Alcian Blue	Hi-Media	RM471	For sufated gycosaminoglycans staining
Alizarin Red S	S D Fine-Chem Limited	26048-25G	For calcium deposition
Amphotericin B	HiMedia	A011	2.5 µg/mL
Basic fibroblast growth factor (bFGF)	Sino Biologicals	10014-HNAE	5 ng/mL
BCIP/NBT ALP Substrate	Sigma	B5655-5TAB	For ALP staining
Biological safety cabinet
BSA	HiMedia	MB-083	Long name: Bovine Serum Albumin (1.25 mg/mL )
Cell strainer	HiMedia	TCP-182	70 µm
Centrifuge	REMI
Ciprofloxacin	RANBAXY LAB. Limited	B17407T1	2.5 µg/mL
Crystal Violet	S D Fine-Chem Limited	42555
D(+)-glucose	Merck	1.94925.0521	25 mM
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D2915	1 µM
DMEM LG	SIGMA	D5523	Long name: Dulbecco’s Modified Eagle’s Media Low Glucose
Ethanol	Merck	100983
FBS	Gibco	10270	Long name: Fetal Bovine Serum
Formaldehyde solution 37%-41%	Merck	61780805001730
Indomethacin	Sigma-Aldrich	I7378	100 µM
Insulin	Sigma-Aldrich	I9278	10 µg/mL
Inverted microscope	Nikon Eclipse TS 100
ITS + 1	Sigma-Aldrich	I2521-5mL	Long name: insulin, transferrin, sodium selenite + linoleic-BSA
L-Proline	HiMedia	TO-109-25G	1 mM
Magnesium chloride	Merck	61751605001730	For lysis buffer
Methanol	Meck	1.07018.2521
Micropipettes and sterile tips (20 µL, 200 µL, 1000 µL)	Thermoscientific
MUSE Cell analyser	Merck Millipore		For cell counting
OCT compound	Tissue-Tek	4583	Long name: Optimal Cutting Temperature
Oil Red O dye	S D Fine-Chem Limited	54304	For lipid vacuole staining
Penicillin-Streptomycin	HiMedia	A007	100 U/mL
Petri dishes (150 mm and 90 mm)	NEST
Safranin O	S D Fine-Chem Limited	50240	For sufated gycosaminoglycans staining
Sodium citrate	Sigma-Aldrich	C3434	3.4 % (w/v)
Sterile scissors, forceps and scalpels			For isolation of IFP-MSC
Sucrose	Merck	1.94953.0521	35 % (w/v)
TGF-β1	Sino Biologicals		Long name: Transforming growth factor- β1 (10 ng/mL)
Tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2	Thermoscientific
Tris buffer	Merck	61771405001730	For lysis buffer
Triton X100	S D Fine-Chem Limited	40632	For lysis buffer
Type II collagenase	Gibco	17101015	1.5 mg/mL
Vitamin D3	Sigma	C9756-1G	10 nM
Well plates (6 -WP and 24-WP)	NEST