Un test de traction optimisé à molécule unique pour la quantification de la phosphorylation des protéines
Summary
Le présent protocole décrit la préparation des échantillons et l’analyse des données pour quantifier la phosphorylation des protéines à l’aide d’un test amélioré d’extraction à molécule unique (SiMPull).
Abstract
La phosphorylation est une modification post-traductionnelle nécessaire qui régule la fonction des protéines et dirige les résultats de la signalisation cellulaire. Les méthodes actuelles de mesure de la phosphorylation des protéines ne peuvent pas préserver l’hétérogénéité de la phosphorylation entre les protéines individuelles. Le test SiMPull (Single-Molecule Pull-Down) a été développé pour étudier la composition de complexes macromoléculaires par immunoprécipitation de protéines sur un couvercle en verre suivie d’une imagerie à molécule unique. La technique actuelle est une adaptation de SiMPull qui fournit une quantification robuste de l’état de phosphorylation des récepteurs membranaires pleine longueur au niveau de la molécule unique. L’imagerie de milliers de récepteurs individuels de cette manière permet de quantifier les modèles de phosphorylation des protéines. Le présent protocole détaille la procédure SiMPull optimisée, de la préparation de l’échantillon à l’imagerie. L’optimisation des protocoles de préparation du verre et de fixation des anticorps améliore encore la qualité des données. Le protocole actuel fournit un code pour l’analyse des données à molécule unique qui calcule la fraction des récepteurs phosphorylés dans un échantillon. Bien que ces travaux se concentrent sur la phosphorylation du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR), le protocole peut être généralisé à d’autres récepteurs membranaires et molécules de signalisation cytosoliques.
Introduction
La signalisation associée à la membrane est réglée par une combinaison d’activation des récepteurs membranaires induits par les ligands et de recrutement de protéines accessoires en aval qui propagent le signal. La phosphorylation des tyrosines clés dans les queues cytoplasmiques des récepteurs est essentielle pour initier la formation de complexes de signalisation, ou signalosomes 1,2. Par conséquent, une question importante en biologie est de savoir comment les modèles de phosphorylation sont créés et maintenus pour recruter des partenaires de signalisation et dicter les résultats cellulaires. Cela comprend la compréhension de l’hétérogénéité de la phosphorylation des récepteurs, à la fois en abondance et dans les modèles spécifiques de phosphotyrosine qui peuvent fournir un moyen de manipuler les sorties de signalisation en dictant la composition du signalosome 3,4,5,6,7. Cependant, il existe des limites dans les méthodes actuelles pour interroger la phosphorylation des protéines. L’analyse par transfert de Western est excellente pour décrire les tendances de la phosphorylation des protéines, mais elle est semi-quantitative8 et ne fournit pas d’informations sur l’hétérogénéité du système, car des milliers à des millions de récepteurs sont moyennés ensemble. Bien que les transferts de Western permettent de sonder un échantillon à l’aide d’anticorps spécifiques aux phosphos contre des tyrosines spécifiques, ils ne peuvent pas fournir d’informations sur les modèles de phosphorylation multisite au sein d’une même protéine. La phosphoprotéomique quantitative rend compte de l’abondance de la phosphotyrosine, mais il existe des limites à la détection de la phosphorylation multisite, car les résidus d’intérêt doivent être situés dans le même peptide (généralement 7-35 acides aminés) qui est généré par la digestion enzymatique 9,10,11.
Pour surmonter les limites mentionnées ci-dessus, le test SiMPull (Single-Molecule Pull-Down) a été adapté pour quantifier les états de phosphorylation des récepteurs intacts au niveau de la molécule unique. SiMPull a été démontré pour la première fois comme un outil puissant pour interroger les complexes macromoléculaires par Jain et al.12,13. Dans SiMPull, les complexes macromoléculaires ont été immunoprécipités (IP) sur des couvercles de verre fonctionnalisés par anticorps, puis analysés par microscopie à molécule unique pour le nombre de sous-unités protéiques et la co-IP avec des composants complexes12. Une modification de Kim et al.14, appelée SiMBlot, a été la première à utiliser une variante de SiMPull pour analyser la phosphorylation des protéines dénaturées. Le protocole SiMBlot repose sur la capture de protéines de surface cellulaire biotinylées à l’aide de couvercles recouverts de NeutrAvidin, qui sont ensuite sondés pour la phosphorylation avec un marquage d’anticorpsspécifiques au phospho 14. Malgré ces progrès, des améliorations étaient nécessaires pour rendre la quantification de la modification post-traductionnelle plus robuste et applicable à un plus large éventail de protéines.
Le présent protocole décrit une approche SiMPull optimisée qui a été utilisée pour quantifier les modèles de phosphorylation du récepteur du facteur de croissance épidermique intact (EGFR) en réponse à une gamme de conditions de ligand et de mutations oncogènes15. Bien que ces travaux se concentrent sur l’EGFR, cette approche peut être appliquée à n’importe quel récepteur membranaire et protéine cytosolique d’intérêt (POI), pour lesquels des anticorps de qualité sont disponibles. Le protocole comprend des étapes pour réduire l’autofluorescence des échantillons, une conception de réseau d’échantillons qui nécessite un volume d’échantillon minimal avec la préparation simultanée de jusqu’à 20 échantillons, et l’optimisation des conditions de marquage et de fixation des anticorps. Des algorithmes d’analyse de données ont été développés pour la détection et la quantification de protéines phosphorylées à molécule unique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit ici a été optimisé pour permettre des mesures quantitatives de la phosphorylation des récepteurs au niveau d’une seule protéine. Plusieurs modifications simples mais importantes du protocole SiMPull ont été développées pour améliorer la fiabilité de la mesure pour la détection de la phospho-tyrosine, y compris la réduction de l’autofluorescence avec le traitement NaBH4 et la postfixation de l’échantillon pour prévenir la dissociation des anticorps. L’utilisation du m…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health R35GM126934, R01AI153617 et R01CA248166 à DSL. EMB a été soutenu par le programme ASERT-IRACDA (NIH K12GM088021) et JAR par le programme UNM MARC (NIH 2T34GM008751-20). Nous remercions l’utilisation de la ressource partagée de microscopie à fluorescence du Comprehensive Cancer Center de l’Université du Nouveau-Mexique, soutenue par NIH P30CA118100. Nous tenons à remercier les Drs Ankur Jain et Taekijip Ha, dont le développement original de SiMPull a inspiré ce travail.
ES-C adresse actuelle: Groupe immunodynamique, Laboratoire d’immunologie intégrative du cancer, Centre de recherche sur le cancer, Institut national du cancer, Bethesda
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | MTC Bio | C2000 | |
| 10 mM Tris-HCl pH 7.4 | |||
| 10 mM Tris-HCl pH 8.0/ 50 mM NaCl | T50 Buffer | ||
| 100 mm Tissue Culture dish | CELLTREAT | 229620 | Storage of piranha etched glass/arrays |
| 15 mL conical tube | |||
| 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Hazardous |
| 50 mL conical tube | Functionalized Glass storage/ KOH reuse | ||
| 50 mM Tris-HCl pH 7.2/150 mM NaCl | Lysis Buffer Component | ||
| 60 mm Tissue Culture dish | Corning | 430166 | |
| 8% Glutaraldehyde Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 16020 | Hazardous |
| Acetone (C3H6O) | Millipore Sigma | 270725 | Hazardous |
| Alexa Fluor 647 NHS Ester | Thermo Fisher Scientific | A-20006 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Anti-Human EGFR (External Domain) – Biotin | Leinco Technologies, Inc | E101 | |
| Anti-p-Tyr Antibody (PY99) Alexa Fluor 647 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7020 AF647 | |
| Bath-sonicator | Branson | 1200 | |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23227 | |
| Biotin-PEG | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA, MW 5,000 | |
| Bovine serum albumin | Gold Biotechnology | A-420-1 | Tyrode's Buffer Component |
| Buchner funnel | |||
| Bunsen burner | |||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Millipore Sigma | C4901 | Tyrode's Buffer Component |
| Cell Scraper | Bioworld | 30900017-1 | |
| Conical Filtering Flask | Fisher Scientific | S15464 | |
| Coplin Jar | WHEATON | 900470 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Coverslips 24 x 60 #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 63793 | |
| DipImage | https://diplib.org/ | ||
| DMEM | Caisson Labs | DML19-500 | |
| emCCD camera | Andor iXon | ||
| Fetal Bovine Serum, Optima | Bio-Techne | S12450H | Heat Inactivated |
| Fusion 360 software | Autodesk | ||
| Geneticin G418 Disulfate | Caisson Labs | G030-5GM | |
| Glacial Acetic Acid (CH3COOH) | JT Baker | JTB-9526-01 | Hazardous |
| Glass serological pipettes | |||
| Glass Stir Rod | |||
| Glucose (D-(+)-Glucose) | Millipore Sigma | D9434 | Tyrode's Buffer Component |
| Halt Phosphotase and Protease Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Fisher Scientific | 78446 | Lysis Buffer Component |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | Tyrode's Buffer Component |
| Hydrochloric Acid (HCl) | VWR | BDH7204-1 | Hazardous |
| Hydrogen Peroxide (H2O2) (3%) | HX0645 | ||
| Hydrogen Peroxide (H2O2) (30%) | EMD Millipore | HX0635-2 | |
| Ice | |||
| IGEPAL CA-630 (NP-40) | Sigma Aldrich | I8896 | Lysis Buffer Component |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Immersol 518F immersion oil | Zeiss | 444960-0000-000 | |
| in-house vacuum line | |||
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-164 | |
| Magnessium Chloride Hexahydrate (MgCl2-6H2O) | MPBio | 2191421 | Tyrode's Buffer Component |
| Matlab | Mathworks | Curve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox, and Statistics and Machine Learning toolbox | |
| Methanol (CH3OH) | IBIS Scientific | MX0486-1 | Hazardous |
| Milli-Q water | |||
| Mix-n-Stain CF Dye Antibody Labeling Kits | Biotium | 92245 | Suggested conjugation kit |
| mPEG | Laysan Bio | mPEG-succinimidyl valerate, MW 5,000 | |
| N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilane | UCT United Chemical | A0700 | Hazardous |
| Nanogrid | Miraloma Tech | ||
| NeutrAvidin Biotin Binding Protein | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Nitrogen (compressed gas) | |||
| NVIDIA GPU with CUDA | Look for compatibility at https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html | ||
| Olympus iX71 Microscope | Olympus | ||
| Parafilm M Sealing Film | The Lab Depot | HS234526C | |
| PBS pH 7.4 | Caisson Labs | PBL06 | |
| PC-200 Analog Hot Plate | Corning | 6795-200 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-163 | |
| Phospho-EGF Receptor (Tyr1068) (1H12) Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2236BF | |
| Potassium Chloride (KCl) | Millipore Sigma | 529552 | Tyrode's Buffer Component |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Millipore Sigma | 1050330500 | Hazardous |
| Premium PLA Filament, 1.75 mm diameter | Raise 3D | PMS:2035U/RAL:3028 | Printing temperature range: 205-235 °C |
| Pro2 3D printer | Raise 3D | ||
| Pyrex 1 L beaker | |||
| PYREX 100 mL storage bottles | Corning | 1395-100 | CH3OH/C3H6O reuse |
| Pyrex 250 mL beakers | |||
| Pyrex 4 L beaker | |||
| Quad-view Image Splitter | Photometrics | Model QV2 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | EP-5415R | |
| RevCount Cell Counters, EVE Cell Counting Slides | VWR | 10027-446 | |
| Semrock emission filters: blue (445/45 nm), green (525/45 nm), red (600/37 nm), far-red (685/40 nm) | Semrock | LF405/488/561/635-4X4M-B-000 | |
| Serological pipette controller | |||
| Serological Pipettes | |||
| smite single molecule analysis package | https://github.com/LidkeLab/smite.git | ||
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma Aldrich | S6014 | Hazardous |
| Sodium Borohydride (NaBH4) | Millipore Sigma | 452874 | Tyrode's Buffer Component |
| Sodium Chloride (NaCl) | Millipore Sigma | S9625 | Activate by successive heat and pH cycling |
| Sodium Hydroxide | VWR | BDH3247-1 | |
| Sodium Orthovanadate (Na3VO4) | Millipore Sigma | S6508 | Hazardous |
| Sulfuric Acid (H2SO4) | Millipore Sigma | 258105 | Hazardous |
| TetraSpeck Microspheres | Thermo Fisher Scientific | T7279 | multi-fluorescent beads |
| Tris (Trizma) base | Millipore Sigma | T1503 | |
| Trypan blue stain, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific | 25300120 |
Referências
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