Un ensayo optimizado de extracción de una sola molécula para la cuantificación de la fosforilación de proteínas
Summary
El presente protocolo describe la preparación de muestras y el análisis de datos para cuantificar la fosforilación de proteínas utilizando un ensayo mejorado de extracción de una sola molécula (SiMPull).
Abstract
La fosforilación es una modificación posttraduccional necesaria que regula la función de la proteína y dirige los resultados de la señalización celular. Los métodos actuales para medir la fosforilación de proteínas no pueden preservar la heterogeneidad en la fosforilación a través de proteínas individuales. El ensayo pull-down de una sola molécula (SiMPull) se desarrolló para investigar la composición de complejos macromoleculares a través de la inmunoprecipitación de proteínas en una cubierta de vidrio seguida de imágenes de una sola molécula. La técnica actual es una adaptación de SiMPull que proporciona una cuantificación robusta del estado de fosforilación de los receptores de membrana de longitud completa a nivel de molécula única. La obtención de imágenes de miles de receptores individuales de esta manera permite cuantificar los patrones de fosforilación de proteínas. El presente protocolo detalla el procedimiento Optimizado de SiMPull, desde la preparación de la muestra hasta la obtención de imágenes. La optimización de la preparación de vidrio y los protocolos de fijación de anticuerpos mejora aún más la calidad de los datos. El protocolo actual proporciona código para el análisis de datos de una sola molécula que calcula la fracción de receptores fosforilados dentro de una muestra. Si bien este trabajo se centra en la fosforilación del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), el protocolo puede generalizarse a otros receptores de membrana y moléculas de señalización citosólica.
Introduction
La señalización asociada a la membrana se sintoniza mediante una combinación de activación del receptor de membrana inducida por ligandos y reclutamiento de proteínas accesorias aguas abajo que propagan la señal. La fosforilación de tirosinas clave en las colas citoplasmáticas receptoras es fundamental para iniciar la formación de complejos de señalización, o tirosomas 1,2. Por lo tanto, una pregunta importante en biología es cómo se crean y mantienen los patrones de fosforilación para reclutar socios de señalización y dictar los resultados celulares. Esto incluye la comprensión de la heterogeneidad de la fosforilación del receptor, tanto en abundancia como en los patrones específicos de fosfotirosina que pueden proporcionar un medio para manipular las salidas de señalización al dictar la composición del signalosoma 3,4,5,6,7. Sin embargo, existen limitaciones en los métodos actuales para interrogar la fosforilación de proteínas. El análisis de Western blot es excelente para describir las tendencias de la fosforilación de proteínas, pero essemicuantitativo 8 y no proporciona información sobre la heterogeneidad del sistema porque se promedian entre miles y millones de receptores. Si bien los western blots permiten sondear una muestra utilizando anticuerpos fosfoespecíficos contra tirosinas específicas, no pueden proporcionar información sobre los patrones de fosforilación multisitio dentro de la misma proteína. La fosfoproteómica cuantitativa informa sobre la abundancia de fosfotirosina, pero existen limitaciones para detectar la fosforilación multisitio, ya que los residuos de interés deben ubicarse dentro del mismo péptido (típicamente 7-35 aminoácidos) que se genera por la digestión enzimática 9,10,11.
Para superar las limitaciones mencionadas anteriormente, el ensayo de extracción de una sola molécula (SiMPull) se ha adaptado para cuantificar los estados de fosforilación de los receptores intactos a nivel de molécula única. SiMPull fue demostrado por primera vez como una poderosa herramienta para interrogar complejos macromoleculares por Jain et al.12,13. En SiMPull, los complejos macromoleculares fueron inmunoprecipitados (IP) en cubiertas de vidrio funcionalizadas por anticuerpos y luego analizados a través de microscopía de molécula única para el número de subunidades de proteínas y co-IP con componentes complejos12. Una modificación de Kim et al.14, denominada SiMBlot, fue la primera en utilizar una variación de SiMPull para analizar la fosforilación de proteínas desnaturalizadas. El protocolo SiMBlot se basa en la captura de proteínas biotiniladas de la superficie celular utilizando cápsulas recubiertas de NeutrAvidin, que luego se sondean para la fosforilación con el etiquetado de anticuerpos fosfoespecíficos14. A pesar de estos avances, se necesitaron mejoras para hacer que la cuantificación de la modificación posttraduccional fuera más robusta y aplicable a una gama más amplia de proteínas.
El presente protocolo describe un enfoque optimizado de SiMPull que se utilizó para cuantificar los patrones de fosforilación del receptor intacto del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) en respuesta a una variedad de condiciones de ligando y mutaciones oncogénicas15. Si bien este trabajo se centra en EGFR, este enfoque se puede aplicar a cualquier receptor de membrana y proteínas citosólicas de interés (POI), para las cuales se dispone de anticuerpos de calidad. El protocolo incluye pasos para reducir la autofluorescencia de la muestra, un diseño de matriz de muestras que requiere un volumen mínimo de muestras con la preparación simultánea de hasta 20 muestras, y la optimización del etiquetado de anticuerpos y las condiciones de fijación. Se han desarrollado algoritmos de análisis de datos para la detección de moléculas individuales y la cuantificación de proteínas fosforiladas.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito aquí se optimizó para permitir mediciones cuantitativas de la fosforilación del receptor a nivel de proteína única. Se desarrollaron varias modificaciones sencillas pero importantes al protocolo SiMPull que mejoraron la confiabilidad de la medición para la detección de fosfo-tirosina, incluida la reducción de la autofluorescencia con el tratamiento con NaBH4 y la colocación posterior de la muestra para prevenir la disociación de anticuerpos. El uso de la máscara de canal verde …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud R35GM126934, R01AI153617 y R01CA248166 a DSL. EMB fue apoyado a través del programa ASERT-IRACDA (NIH K12GM088021) y JAR por el programa UNM MARC (NIH 2T34GM008751-20). Agradecemos el uso del recurso compartido de microscopía de fluorescencia del Centro Integral del Cáncer de la Universidad de Nuevo México, respaldado por NIH P30CA118100. Queremos reconocer a los Dres. Ankur Jain y Taekijip Ha, cuyo desarrollo original de SiMPull inspiró este trabajo.
ES-C presente dirección: Immunodynamics Group, Laboratory of Integrative Cancer Immunology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, Bethesda
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | MTC Bio | C2000 | |
| 10 mM Tris-HCl pH 7.4 | |||
| 10 mM Tris-HCl pH 8.0/ 50 mM NaCl | T50 Buffer | ||
| 100 mm Tissue Culture dish | CELLTREAT | 229620 | Storage of piranha etched glass/arrays |
| 15 mL conical tube | |||
| 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Hazardous |
| 50 mL conical tube | Functionalized Glass storage/ KOH reuse | ||
| 50 mM Tris-HCl pH 7.2/150 mM NaCl | Lysis Buffer Component | ||
| 60 mm Tissue Culture dish | Corning | 430166 | |
| 8% Glutaraldehyde Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 16020 | Hazardous |
| Acetone (C3H6O) | Millipore Sigma | 270725 | Hazardous |
| Alexa Fluor 647 NHS Ester | Thermo Fisher Scientific | A-20006 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Anti-Human EGFR (External Domain) – Biotin | Leinco Technologies, Inc | E101 | |
| Anti-p-Tyr Antibody (PY99) Alexa Fluor 647 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7020 AF647 | |
| Bath-sonicator | Branson | 1200 | |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23227 | |
| Biotin-PEG | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA, MW 5,000 | |
| Bovine serum albumin | Gold Biotechnology | A-420-1 | Tyrode's Buffer Component |
| Buchner funnel | |||
| Bunsen burner | |||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Millipore Sigma | C4901 | Tyrode's Buffer Component |
| Cell Scraper | Bioworld | 30900017-1 | |
| Conical Filtering Flask | Fisher Scientific | S15464 | |
| Coplin Jar | WHEATON | 900470 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Coverslips 24 x 60 #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 63793 | |
| DipImage | https://diplib.org/ | ||
| DMEM | Caisson Labs | DML19-500 | |
| emCCD camera | Andor iXon | ||
| Fetal Bovine Serum, Optima | Bio-Techne | S12450H | Heat Inactivated |
| Fusion 360 software | Autodesk | ||
| Geneticin G418 Disulfate | Caisson Labs | G030-5GM | |
| Glacial Acetic Acid (CH3COOH) | JT Baker | JTB-9526-01 | Hazardous |
| Glass serological pipettes | |||
| Glass Stir Rod | |||
| Glucose (D-(+)-Glucose) | Millipore Sigma | D9434 | Tyrode's Buffer Component |
| Halt Phosphotase and Protease Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Fisher Scientific | 78446 | Lysis Buffer Component |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | Tyrode's Buffer Component |
| Hydrochloric Acid (HCl) | VWR | BDH7204-1 | Hazardous |
| Hydrogen Peroxide (H2O2) (3%) | HX0645 | ||
| Hydrogen Peroxide (H2O2) (30%) | EMD Millipore | HX0635-2 | |
| Ice | |||
| IGEPAL CA-630 (NP-40) | Sigma Aldrich | I8896 | Lysis Buffer Component |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Immersol 518F immersion oil | Zeiss | 444960-0000-000 | |
| in-house vacuum line | |||
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-164 | |
| Magnessium Chloride Hexahydrate (MgCl2-6H2O) | MPBio | 2191421 | Tyrode's Buffer Component |
| Matlab | Mathworks | Curve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox, and Statistics and Machine Learning toolbox | |
| Methanol (CH3OH) | IBIS Scientific | MX0486-1 | Hazardous |
| Milli-Q water | |||
| Mix-n-Stain CF Dye Antibody Labeling Kits | Biotium | 92245 | Suggested conjugation kit |
| mPEG | Laysan Bio | mPEG-succinimidyl valerate, MW 5,000 | |
| N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilane | UCT United Chemical | A0700 | Hazardous |
| Nanogrid | Miraloma Tech | ||
| NeutrAvidin Biotin Binding Protein | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Nitrogen (compressed gas) | |||
| NVIDIA GPU with CUDA | Look for compatibility at https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html | ||
| Olympus iX71 Microscope | Olympus | ||
| Parafilm M Sealing Film | The Lab Depot | HS234526C | |
| PBS pH 7.4 | Caisson Labs | PBL06 | |
| PC-200 Analog Hot Plate | Corning | 6795-200 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-163 | |
| Phospho-EGF Receptor (Tyr1068) (1H12) Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2236BF | |
| Potassium Chloride (KCl) | Millipore Sigma | 529552 | Tyrode's Buffer Component |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Millipore Sigma | 1050330500 | Hazardous |
| Premium PLA Filament, 1.75 mm diameter | Raise 3D | PMS:2035U/RAL:3028 | Printing temperature range: 205-235 °C |
| Pro2 3D printer | Raise 3D | ||
| Pyrex 1 L beaker | |||
| PYREX 100 mL storage bottles | Corning | 1395-100 | CH3OH/C3H6O reuse |
| Pyrex 250 mL beakers | |||
| Pyrex 4 L beaker | |||
| Quad-view Image Splitter | Photometrics | Model QV2 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | EP-5415R | |
| RevCount Cell Counters, EVE Cell Counting Slides | VWR | 10027-446 | |
| Semrock emission filters: blue (445/45 nm), green (525/45 nm), red (600/37 nm), far-red (685/40 nm) | Semrock | LF405/488/561/635-4X4M-B-000 | |
| Serological pipette controller | |||
| Serological Pipettes | |||
| smite single molecule analysis package | https://github.com/LidkeLab/smite.git | ||
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma Aldrich | S6014 | Hazardous |
| Sodium Borohydride (NaBH4) | Millipore Sigma | 452874 | Tyrode's Buffer Component |
| Sodium Chloride (NaCl) | Millipore Sigma | S9625 | Activate by successive heat and pH cycling |
| Sodium Hydroxide | VWR | BDH3247-1 | |
| Sodium Orthovanadate (Na3VO4) | Millipore Sigma | S6508 | Hazardous |
| Sulfuric Acid (H2SO4) | Millipore Sigma | 258105 | Hazardous |
| TetraSpeck Microspheres | Thermo Fisher Scientific | T7279 | multi-fluorescent beads |
| Tris (Trizma) base | Millipore Sigma | T1503 | |
| Trypan blue stain, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific | 25300120 |
Referências
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