MALDI-TOF 질량 분광법을 이용한 효소적 분해로 인한 RNA 단편의 확인
Summary
MALDI-TOF는 산화된 RNA와 엑소리보뉴클레아제 Xrn-1 사이의 반응성으로부터 수득된 단편을 특성화하는데 사용되었다. 본 프로토콜은 RNA 및/또는 DNA를 포함하는 다른 공정에 적용될 수 있는 방법론을 기술한다.
Abstract
RNA는 생명의 모든 도메인에 존재하는 생체 고분자이며, 다른 분자 및 / 또는 반응성 종, 예를 들어 DNA, 단백질, 이온, 약물 및 자유 라디칼과의 상호 작용은 유비쿼터스입니다. 결과적으로, RNA는 절단, 분해 또는 변형을 포함한 다양한 반응을 겪으며 뚜렷한 기능과 함의를 가진 생물학적으로 관련된 종으로 이어집니다. 한 가지 예는 반응성 산소 종 (ROS)의 존재 하에서 발생할 수 있는 7,8-디히드로-8-옥소구아닌 (8-oxoG)에 대한 구아닌의 산화이다. 전반적으로, 그러한 제품과 변형을 특징 짓는 절차는 과학계에 크게 가치가 있습니다. 이를 위해, 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 비행 시간(MALDI-TOF) 질량 분광법은 널리 사용되는 방법이다. 본 프로토콜은 효소적 처리 후에 형성된 RNA 단편을 특성화하는 방법을 기술한다. 선택된 모델은 RNA와 엑소리보뉴클레아제 Xrn-1 사이의 반응을 사용하며, 여기서 효소 소화는 산화된 부위에서 중단된다. 두 개의 20-뉴클레오티드 긴 RNA 서열 [5′-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] 및 [5′-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU]를 고상 합성을 통해 수득하고, UV-vis 분광법에 의해 정량하고, MALDI-TOF를 통해 특성화하였다. 수득된 가닥은 이어서 (1) 5′-인산화되고 MALDI-TOF를 통해 특성화되고; (2) Xrn-1로 처리된 단계; (3) 여과 및 탈염; (4) MALDI-TOF를 통해 분석. 이러한 실험적 셋업은 Xrn-1의 실속과 관련된 단편의 명백한 동정을 이끌었다: [5′-H2PO4-(8-옥소G)g cua AAA 구], [5′-H2PO4-(8-옥소G)(8-옥소G) cua aaa gu], 및 [5′-H2PO4-(8-옥소G) cua AAA 구]. 기술된 실험은 200개의 피코몰의 RNA (MALDI 분석에 사용된 20 pmol)로 수행되었다; 그러나 더 적은 양은이 작업에 사용 된 것보다 더 많은 전력을 가진 레이저 소스를 사용하여 분광계로 감지 가능한 피크를 초래할 수 있습니다. 중요하게도, 기술된 방법론은 일반화될 수 있고 잠재적으로 RNA 및 DNA를 포함하는 다른 공정에 대한 생성물 식별로 확장될 수 있고, 다른 생화학적 경로의 특성화/해명에 도움이 될 수 있다.
Introduction
MALDI-TOF 1,2,3은 다양한 크기와 특성을 가진 분자의 특성화 및/또는 검출을 위해 널리 사용되는 기술입니다. 그것의 용도 중 일부는 천연 자원으로부터의 탄닌 검출4, 식품5의 대사 산물 이미징, 세포 약물 표적 또는 마커6의 발견 또는 모니터링, 임상 진단7과 같은 다양한 응용을 포함한다. 본 연구와 관련성 중 하나는 MALDI-TOF를 DNA 또는 RNA와 함께 사용하는 것이며, 올리고뉴클레오티드에 대한 사용은 삼십 년8 이상으로 거슬러 올라가며, 몇 가지 한계가 지적되었다. 이 기술은 이제 바이오폴리머(9)를 특성화하고 화학적 및 생화학적 반응, 예를 들어 RNA 10에서 도금된 부위의 특성화, 가닥 절단11,12에 따른 RNA 단편의 확인, 또는 단백질-DNA 가교결합의 형성(13)을 식별/이해하기 위해 신뢰할 수 있고 일반적으로 사용되는 수단으로 진화되었다. . 따라서이 기술을 사용하는 중요한 측면을 설명하고 강조하는 것이 중요합니다. MALDI-TOF의 기초는 비디오 포맷 뿐만 아니라도 14에서 설명되었으며, 여기서 더 이상 설명되지 않을 것이다. 더욱이, DNA 또는 단백질 맥락에서의 그의 적용은 상기 포맷15,16,17에 이전에 기술되고 예시되었다.
효소적 가수분해 후에 형성된 RNA 단편을 검출하기 위한 프로토콜이 본원에 보고된다. 실험 모델은 우리 그룹18에 의해 발표 된 최근 발견에 기초하여 선택되었으며, 여기서 MALDI-TOF는 exoribonuclease Xrn-1과 산화 병변 8-oxoG를 포함하는 RNA의 올리고뉴클레오티드 사이의 독특한 반응성을 결정하기 위해 사용되었습니다. 20-뉴클레오티드 긴 가닥을 고체상 합성19를 통해 수득하였고, [5′-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] 및 [5′-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], Xrn-1은 앞서 기술된 보고서20에 따라 발현되고 정제되었다. 간단히 말해서, Xrn-121은 산화된 RNA22를 포함한 여러 유형의 RNA를 분해하는 다양한 주요 생물학적 역할을 갖는 5′-3′ 엑소리보뉴클레아제이다. 효소의 처리성이 8-oxoG를 만나면 멈추는 것으로 밝혀졌으며, 이는 5′-인산화된 말단[5′-H2PO4-(8-옥소G)G CUA AAA GU], [5′-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) cua AAA gu], 및 [5′-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]18을 함유하는 RNA 단편으로 이어졌다.
마지막으로, 질량 분광법은 다양한 방법론을 통해 다른 목적에 적응할 수있는 강력한 방법이라는 점에 유의하는 것이 중요합니다23,24; 따라서 올바른 이온화 방법과 다른 실험 설정을 선택하는 것이 가장 중요합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 워크플로우의 주요 과제는 실험을 마무리하고 질량 분광 분석을 수행하는 사이에 있었습니다. 실험은 콜로라도 덴버 대학에서 수행되고 완료되었으며 콜로라도 주립 대학 시설로 (하룻밤) 운송되었습니다. 데이터 수집은 편의에 따라 수령시 수행되었습니다. 몇 가지 예기치 않은 상황으로 인해 프로세스가 시간 지연되었습니다. 일례로, 예상치 못한 기기 오작동으로 인해 시료를 발견하거나 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 세 기관, 두 연구 그룹 및 하나의 핵심 시설 간의 공동 노력이라는 점에 유의해야합니다. 분배 및 작업량은 다음과 같이 수행되었다: 단백질 (Xrn-1) 발현은 덴버 대학 (Denver, CO)에서 수행되었다. 올리고뉴클레오티드 합성, 정량화 및 실험(주로 효소적 분해)은 콜로라도 덴버 대학(Denver, CO)에서 수행되었다. 최적화도 거기에서 수행되었습니다. MALDI-TOF 탐지, 인수 및 분석은 콜로라도 주립 대학의 분석 자원 핵심 시설에서 수행되었습니다. (포트 콜린스, CO). SS는 UROP 어워드(CU Denver)와 유레카 보조금(CU Denver)을 인정하여 지원을 받고 싶습니다. E. G.C.는 R00GM115757 을 통해 NIGMS의 지원을 인정합니다. MJER는 1R15GM132816 을 통해 NIGMS의 지원을 인정합니다. K.B.는 리소스 ID: SCR_021758을 승인합니다. 이 작품은 또한 Henry Dreyfus Foundation의 교사 – 학자 상 (MJER), TH-21-028에 의해 지원되었습니다.
Materials
| 0.6 mL MCT Graduated Violet | Fisher Scientific | 05-408-127 | |
| 6’-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98% | Sigma Aldrich | 480-66-0 | |
| Acetonitrile 99.9%, HPLC grade | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| Adenosine triphosphate, 10 mM | New Englang Bioscience | P0756S | |
| Ammonium citrate, dibasic 98% | Sigma Aldrich | 3012-65-5 | |
| Ammonium Fluoride 98.0%, ACS grade | Alfa Aesar | 12125-01-8 | |
| Bruker bacterial test standard | Bruker Daltonics | 8255343 | |
| Commercial source of Xrn-1 | New England BioLabs | M0338S | |
| Diethyl pyrocarbonate, 97% | ACROS Organics | A0368487 | |
| Flex analysis software | Bruker daltonics | FlexAnalysis software version 3.4, Bruker Daltonics | |
| Lambda 365 UV-vis spectrophotometer | Perkin Elmer | ||
| MALDI plate: MSP 96 ground steel target | Bruker Daltonics | 280799 | |
| Mass Spectrometer | Bruker | Microflex LRFTOF mass spectrometer (Bruker Daltonics, Billerica, MA) | |
| Mili-Q IQ 7000 | Milipore Sigma | A Mili-Q system was used to purify all water used in this work | |
| Nanosep Centrifugal Devices with OmegaTM Membrane 10 K, blue (24/pkg) | Pall Corporation | OD010C33 | filter media, Omega (modified polyethersulfone) 10 K pore size |
| NEBuffer 3 | New England Biolabs | B7003S | This is solution B |
| Oligo Analyzer tool | IDT-DNA | https://www.idtdna.com/calc/analyzer | |
| Pipette tips P10 | Fisher Scientific | 02-707-441 | |
| Pipette tips P200 | Fisher Scientific | 02-707-419 | |
| RNase Away | Molecular BioProducts | 7005-11 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England BioLabs | M0201S | |
| T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer | New England BioLabs | B0201S | This is solution A |
| Triflouroacetic Acid | Alfa Aesar | 76-05-1 | |
| Xrn-1 exoribonuclease | Expressed in house | See ref. 20 | |
| ZipTip Pipette Tips for Sample preparation | Millipore | ZTC 18S 096 | 10 µL pipette tips loaded with a C18 standard 0.6 µL bed |
Referências
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