Identificación de fragmentos de ARN resultantes de la degradación enzimática mediante espectrometría de masas MALDI-TOF
Summary
MALDI-TOF se utilizó para caracterizar fragmentos obtenidos de la reactividad entre el ARN oxidado y la exoribonucleasa Xrn-1. El presente protocolo describe una metodología que puede aplicarse a otros procesos que involucran ARN y/o ADN.
Abstract
El ARN es un biopolímero presente en todos los dominios de la vida, y sus interacciones con otras moléculas y / o especies reactivas, por ejemplo, ADN, proteínas, iones, medicamentos y radicales libres, son omnipresentes. Como resultado, el ARN sufre varias reacciones que incluyen su escisión, degradación o modificación, lo que lleva a especies biológicamente relevantes con distintas funciones e implicaciones. Un ejemplo es la oxidación de la guanina a 7,8-dihidro-8-oxoguanina (8-oxoG), que puede ocurrir en presencia de especies reactivas de oxígeno (ROS). En general, los procedimientos que caracterizan tales productos y transformaciones son en gran medida valiosos para la comunidad científica. Con este fin, la espectrometría de masas de tiempo de vuelo por ionización por láser asistida por matriz (MALDI-TOF) es un método ampliamente utilizado. El presente protocolo describe cómo caracterizar los fragmentos de ARN formados después del tratamiento enzimático. El modelo elegido utiliza una reacción entre el ARN y la exoribonucleasa Xrn-1, donde la digestión enzimática se detiene en los sitios oxidados. Dos secuencias largas de ARN de 20 nucleótidos [5′-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] y [5′-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] se obtuvieron mediante síntesis pt fase sólida, cuantificadas por espectroscopia UV-vis, y caracterizadas mediante MALDI-TOF. Las hebras obtenidas fueron entonces (1) 5′-fosforiladas y caracterizadas vía MALDI-TOF; (2) tratado con Xrn-1; (3) filtrado y desalinizado; (4) analizado vía MALDI-TOF. Esta configuración experimental condujo a la identificación inequívoca de los fragmentos asociados con el estancamiento de Xrn-1: [5′-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5′-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], y [5′-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]. Los experimentos descritos se llevaron a cabo con 200 picomoles de ARN (20 pmol utilizados para los análisis MALDI); sin embargo, cantidades más bajas pueden resultar en picos detectables con espectrómetros que utilizan fuentes láser con más potencia que la utilizada en este trabajo. Es importante destacar que la metodología descrita puede generalizarse y potencialmente extenderse a la identificación de productos para otros procesos que involucran ARN y ADN, y puede ayudar en la caracterización / elucidación de otras vías bioquímicas.
Introduction
MALDI-TOF 1,2,3 es una técnica ampliamente utilizada para la caracterización y/o detección de moléculas de diferentes tamaños y características. Algunos de sus usos incluyen diversas aplicaciones como la detección de taninos de recursos naturales4, la obtención de imágenes de metabolitos en alimentos5, el descubrimiento o monitoreo de dianas o marcadores celulares de fármacos6, y el diagnóstico clínico7, por nombrar algunos. De relevancia para el presente trabajo es el uso de MALDI-TOF con ADN o ARN, con su uso en oligonucleótidos que se remonta a más de tres décadas8, donde se observaron varias limitaciones. Esta técnica ahora ha evolucionado a un medio confiable y comúnmente utilizado para caracterizar ambos biopolímeros9 e identificar / comprender reacciones químicas y bioquímicas, por ejemplo, caracterización de sitios platinados en ARN10, identificación de fragmentos de ARN después de la escisión de la hebra11,12, o formación de enlaces cruzados proteína-ADN13 . Por lo tanto, es valioso ilustrar y resaltar aspectos importantes del uso de esta técnica. Los conceptos básicos de MALDI-TOF se han descrito en formato de video también14 y no se desarrollarán más en este documento. Además, su aplicación en un contexto de ADN o proteína ha sido previamente descrita e ilustrada en dicho formato 15,16,17.
El protocolo para detectar fragmentos de ARN formados después de la hidrólisis enzimática se informa aquí. El modelo experimental fue elegido en base a un hallazgo reciente publicado por nuestro grupo18, donde se utilizó MALDI-TOF para determinar la reactividad única entre la exoribonucleasa Xrn-1 y los oligonucleótidos de ARN que contienen la lesión oxidativa 8-oxoG. Las hebras largas de 20 nucleótidos se obtuvieron mediante síntesis pt fase sólida19, [5′-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] y [5′-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], mientras que Xrn-1 se expresó y purificó siguiendo el informe20 descrito anteriormente. En resumen, Xrn-121 es una exoribonucleasa 5′-3′ con varias funciones biológicas clave que degradan múltiples tipos de ARN, incluido el ARNoxidado 22. Se encontró que la procesividad de la enzima se detiene al encontrarse con 8-oxoG, lo que llevó a fragmentos de ARN que contienen extremos 5′-fosforilados [5′-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5′-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], y [5′-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]18.
Finalmente, es importante señalar que la espectrometría de masas es un método poderoso que, a través de diversas metodologías, puede adaptarse a otros fines23,24; por lo tanto, elegir el método de ionización correcto, así como otra configuración experimental es de suma importancia.
Protocol
Representative Results
Discussion
El principal desafío en este flujo de trabajo surgió entre la finalización de los experimentos y la realización de los análisis espectrométricos de masas. Los experimentos se llevaron a cabo y completaron en la Universidad de Colorado Denver y se enviaron (durante la noche) a las instalaciones de la Universidad Estatal de Colorado. La adquisición de datos se llevó a cabo en el momento de la recepción, según conveniencia. Varias circunstancias inesperadas llevaron a retrasos en el proceso. En un caso, el mal fun…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Es importante señalar que este trabajo fue un esfuerzo de colaboración entre tres instituciones, dos grupos de investigación y una instalación central. La distribución y la carga de trabajo se llevaron a cabo de la siguiente manera: La expresión de proteínas (Xrn-1) se llevó a cabo en la Universidad de Denver (Denver, CO). La síntesis, cuantificación y experimentación de oligonucleótidos (principalmente degradación enzimática) se llevaron a cabo en la Universidad de Colorado Denver (Denver, CO). La optimización también se llevó a cabo allí. La detección, adquisición y análisis de MALDI-TOF se llevaron a cabo en la Instalación Básica de Recursos Analíticos de la Universidad Estatal de Colorado. (Fort Collins, CO). SS desea agradecer un Premio UROP (CU Denver) y becas Eureca (CU Denver) por apoyo. E. G.C. agradece el apoyo de NIGMS, a través de R00GM115757. MJER reconoce el apoyo de NIGMS, a través de 1R15GM132816. K.B. reconoce el ID de recurso: SCR_021758. El trabajo también fue apoyado por un Premio Maestro-Académico (MJER), TH-21-028, de la Fundación Henry Dreyfus.
Materials
| 0.6 mL MCT Graduated Violet | Fisher Scientific | 05-408-127 | |
| 6’-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98% | Sigma Aldrich | 480-66-0 | |
| Acetonitrile 99.9%, HPLC grade | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| Adenosine triphosphate, 10 mM | New Englang Bioscience | P0756S | |
| Ammonium citrate, dibasic 98% | Sigma Aldrich | 3012-65-5 | |
| Ammonium Fluoride 98.0%, ACS grade | Alfa Aesar | 12125-01-8 | |
| Bruker bacterial test standard | Bruker Daltonics | 8255343 | |
| Commercial source of Xrn-1 | New England BioLabs | M0338S | |
| Diethyl pyrocarbonate, 97% | ACROS Organics | A0368487 | |
| Flex analysis software | Bruker daltonics | FlexAnalysis software version 3.4, Bruker Daltonics | |
| Lambda 365 UV-vis spectrophotometer | Perkin Elmer | ||
| MALDI plate: MSP 96 ground steel target | Bruker Daltonics | 280799 | |
| Mass Spectrometer | Bruker | Microflex LRFTOF mass spectrometer (Bruker Daltonics, Billerica, MA) | |
| Mili-Q IQ 7000 | Milipore Sigma | A Mili-Q system was used to purify all water used in this work | |
| Nanosep Centrifugal Devices with OmegaTM Membrane 10 K, blue (24/pkg) | Pall Corporation | OD010C33 | filter media, Omega (modified polyethersulfone) 10 K pore size |
| NEBuffer 3 | New England Biolabs | B7003S | This is solution B |
| Oligo Analyzer tool | IDT-DNA | https://www.idtdna.com/calc/analyzer | |
| Pipette tips P10 | Fisher Scientific | 02-707-441 | |
| Pipette tips P200 | Fisher Scientific | 02-707-419 | |
| RNase Away | Molecular BioProducts | 7005-11 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England BioLabs | M0201S | |
| T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer | New England BioLabs | B0201S | This is solution A |
| Triflouroacetic Acid | Alfa Aesar | 76-05-1 | |
| Xrn-1 exoribonuclease | Expressed in house | See ref. 20 | |
| ZipTip Pipette Tips for Sample preparation | Millipore | ZTC 18S 096 | 10 µL pipette tips loaded with a C18 standard 0.6 µL bed |
Referências
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