剪切力的集合力谱
Summary
集合力谱（EFS）是一种强大的技术，用于在生物物理和生物传感领域对一组集成的生物分子结构进行机械展开和实时传感。
Abstract
基于荧光和机械化学原理的单分子技术在生物传感中提供了卓越的灵敏度。然而，由于缺乏高通量能力，这些技术在生物物理学中的应用受到限制。集合力谱（EFS）通过将单个分子的机械化学研究转换为分子集合的机械化学研究，在研究大量分子结构方面表现出高通量。在该协议中，DNA二级结构（i-motifs）在均质机尖端的转子和定子之间的剪切流中以高达77796 / s的剪切速率展开。证明了流速和分子大小对i基序所经历的剪切力的影响。EFS技术还揭示了DNA i基序和配体之间的结合亲和力。此外，我们已经展示了一种可以通过剪切力驱动的点击化学反应（即机械点击化学）。这些结果确立了利用剪切力控制分子结构构象的有效性。
Introduction
在单分子力谱1（SMFS）中，单个分子结构的机械性能已经通过原子力显微镜，光学镊子和磁性镊子2，3，4等精密仪器进行了研究。受力产生/检测装置中分子的相同方向性要求或磁镊和微型离心力显微镜（MCF）中的小视场的限制5，6，7，8，使用SMFS只能同时研究有限数量的分子。SMFS的低通量阻碍了其在分子识别领域的广泛应用，这需要大量分子的参与。
剪切流提供了一种潜在的解决方案，可以将力施加到大量分子上9。在通道内的液体流动中，越靠近通道表面，流速越慢10.这种流速梯度会导致平行于边界表面的剪切应力。当分子被放置在该剪切流中时，分子重新定向，使其长轴与流动方向对齐，因为剪切力施加到长轴11上。由于这种重新定向，所有相同类型（手柄的大小和长度）的分子预计将在经历相同剪切力的同时沿同一方向对齐。
这项工作描述了一种协议，使用这种剪切流对大量分子结构施加剪切力，如DNA i-motif所示。在该协议中，在均质器尖端的转子和定子之间产生剪切流。本研究发现，折叠的DNAi基序结构可以通过9724-97245 s−1的剪切速率展开。此外， 在L2H2-4OTD配体和i基序之间发现了36 μM的解离常数.该值与通过凝胶移位测定法12测量的31μM的值一致。此外，目前的技术用于展开i基序，其可以暴露螯合铜（I）以催化点击反应。因此，该协议允许人们在合理的时间（短于30分钟）内使用低成本仪器展开大量i-motif结构。鉴于剪切力技术大大提高了力谱的通量，我们将这种技术称为集成力谱（EFS）。该协议旨在提供实验指南，以促进这种基于剪切力的EFS的应用。
Protocol
Representative Results
Discussion
本手稿中描述的方案允许实时研究通过剪切力展开一组生物分子结构的集合。这里给出的结果强调了DNA i基序结构可以通过剪切力展开。配体结合的i基序的展开和剪切力驱动的点击反应是该集合力谱方法的概念验证应用。
图1 显示了仪器设置。均质机发生器尖端和反应室不得相互接触，这对于允许转子和定子之间的稳定剪切流而不会形成气泡至关重要。…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究工作得到了美国国家科学基金会[CBET-1904921]和美国国立卫生研究院[NIH R01CA236350]的支持。
Materials
| 3K MWCO Amicon | Millipore Sigma | ufc900324 | |
| Ascorbic acid | VWR | VWRC0143-100G | |
| Calfluor 488 azide | Click Chemistry Tools | 1369-1 | |
| CuCl | Thermo | ACRO270525000 | |
| Dispersion tip | Switzerland | PT-DA07/2EC-B101 | |
| DNA oligos | IDT | ||
| Dye | IDT | /5Cy5/ | |
| Fluorescence microscope | Janpan | Nikon TE2000-U | |
| Homogenizer | Switzerland | PT 3100D | |
| HPG | Santa Cruz Biotechnology | cs-295271 | |
| KCl | VWR | VWRC26760.295 | |
| MES | VWR | VWRCE169-500G | |
| Quencher | IDT | /3IAbRQSp/ | |
| TBTA | Tokyo Chemical Industry | T2993 | |
| Tris | VWR | VWRCE133-100G |
Referências
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