Ensemble Force Spektroskopie durch Scherkräfte
Summary
Die Ensemblekraftspektroskopie (EFS) ist eine robuste Technik zur mechanischen Entfaltung und Echtzeiterfassung eines Ensemblesatzes biomolekularer Strukturen in biophysikalischen und biosensorischen Bereichen.
Abstract
Einzelmolekültechniken, die auf Fluoreszenz und mechanochemischen Prinzipien basieren, bieten eine überlegene Empfindlichkeit in der biologischen Sensorik. Aufgrund des Mangels an Hochdurchsatzkapazitäten ist die Anwendung dieser Techniken in der Biophysik jedoch begrenzt. Die Ensemble-Kraft-Spektroskopie (EFS) hat einen hohen Durchsatz bei der Untersuchung eines massiven Satzes molekularer Strukturen gezeigt, indem mechanochemische Untersuchungen einzelner Moleküle in solche von molekularen Ensembles umgewandelt wurden. In diesem Protokoll wurden die DNA-Sekundärstrukturen (i-Motive) im Scherstrom zwischen Rotor und Stator einer Homogenisatorspitze mit Scherraten bis zu 77796/s entfaltet. Die Auswirkungen von Durchflussraten und Molekülgrößen auf die Scherkräfte des i-Motivs wurden nachgewiesen. Die EFS-Technik zeigte auch die Bindungsaffinität zwischen DNA-i-Motiven und Liganden. Darüber hinaus haben wir eine Klickchemiereaktion demonstriert, die durch Scherkraft (d.h. Mechano-Klick-Chemie) ausgelöst werden kann. Diese Ergebnisse belegen die Wirksamkeit der Verwendung von Scherkraft zur Kontrolle der Konformation molekularer Strukturen.
Introduction
In der Einzelmolekül-Kraftspektroskopie1 (SMFS) wurden die mechanischen Eigenschaften einzelner Molekülstrukturen mit hochentwickelten Instrumenten wie dem Rasterkraftmikroskop, einer optischen Pinzette und einer Magnetpinzette 2,3,4 untersucht. Eingeschränkt durch die gleiche Richtungsanforderung der Moleküle in den krafterzeugenden/detektierenden Aufbauten oder das kleine Sichtfeld in Magnetpinzetten und dem Miniatur-Zentrifugenkraftmikroskop (MCF)5,6,7,8, kann nur eine begrenzte Anzahl von Molekülen gleichzeitig mit SMFS untersucht werden. Der geringe Durchsatz von SMFS verhindert seine breite Anwendung im Bereich der molekularen Erkennung, was die Beteiligung einer großen Anzahl von Molekülen erfordert.
Die Scherströmung bietet eine mögliche Lösung, um Kräfte auf eine massive Gruppe von Molekülen auszuüben9. In einer Flüssigkeitsströmung innerhalb eines Kanals gilt: Je näher an der Kanaloberfläche, desto langsamer ist die Durchflussrate10. Ein solcher Strömungsgeschwindigkeitsgradient verursacht eine Schubspannung, die parallel zur Grenzfläche verläuft. Wenn ein Molekül in diese Scherströmung gebracht wird, orientiert sich das Molekül so, dass seine Längsachse mit der Strömungsrichtung übereinstimmt, da die Querkraft auf die lange Achse11 aufgebracht wird. Als Ergebnis dieser Neuorientierung wird erwartet, dass sich alle Moleküle des gleichen Typs (Größe und Länge der Griffe) in die gleiche Richtung ausrichten, während sie die gleiche Scherkraft erfahren.
Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll, um eine solche Scherströmung zu verwenden, um Scherkraft auf einen massiven Satz molekularer Strukturen auszuüben, wie das DNA-i-Motiv veranschaulicht. Bei diesem Protokoll wird eine Scherströmung zwischen Rotor und Stator in einer Homogenisatorspitze erzeugt. Die vorliegende Studie ergab, dass die gefaltete DNA-i-Motivstruktur durch Scherraten von 9724-97245 s−1 entfaltet werden konnte. Außerdem wurde eine Dissoziationskonstante von 36 μM zwischen dem L2H2-4OTD-Liganden und dem i-Motiv gefunden. Dieser Wert stimmt mit dem Wert von 31 μM überein, gemessen mit dem Gelverschiebungsassay12. Weiterhin wird die aktuelle Technik verwendet, um das i-Motiv zu entfalten, das das chelatierte Kupfer (I) freilegen kann, um eine Klickreaktion zu katalysieren. Dieses Protokoll ermöglicht es somit, einen großen Satz von i-Motiv-Strukturen mit kostengünstigen Instrumenten in angemessener Zeit (kürzer als 30 min) zu entfalten. Da die Querkrafttechnik den Durchsatz der Kraftspektroskopie drastisch erhöht, nennen wir diese Technik Ensemblekraftspektroskopie (EFS). Dieses Protokoll zielt darauf ab, experimentelle Richtlinien bereitzustellen, um die Anwendung dieses auf Scherkraft basierenden EFS zu erleichtern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das in diesem Manuskript beschriebene Protokoll ermöglicht die Echtzeituntersuchung der Entfaltung eines Ensemblesatzes biomolekularer Strukturen durch Scherkraft. Die hier vorgestellten Ergebnisse unterstreichen, dass DNA-i-Motivstrukturen durch Scherkraft entfaltet werden können. Die Entfaltung des ligandengebundenen i-Motivs und die Scherkraft-betätigten Klickreaktionen waren Proof-of-Concept-Anwendungen für diese Ensemble-Kraftspektroskopie-Methode.
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Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschungsarbeiten wurden von der National Science Foundation [CBET-1904921] und den National Institutes of Health [NIH R01CA236350] bis H. M.
Materials
| 3K MWCO Amicon | Millipore Sigma | ufc900324 | |
| Ascorbic acid | VWR | VWRC0143-100G | |
| Calfluor 488 azide | Click Chemistry Tools | 1369-1 | |
| CuCl | Thermo | ACRO270525000 | |
| Dispersion tip | Switzerland | PT-DA07/2EC-B101 | |
| DNA oligos | IDT | ||
| Dye | IDT | /5Cy5/ | |
| Fluorescence microscope | Janpan | Nikon TE2000-U | |
| Homogenizer | Switzerland | PT 3100D | |
| HPG | Santa Cruz Biotechnology | cs-295271 | |
| KCl | VWR | VWRC26760.295 | |
| MES | VWR | VWRCE169-500G | |
| Quencher | IDT | /3IAbRQSp/ | |
| TBTA | Tokyo Chemical Industry | T2993 | |
| Tris | VWR | VWRCE133-100G |
Referências
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