Summary
Le présent protocole décrit les modifications au microscope électronique à transmission (MET) avec un système d’éclairage lumineux, la fabrication de cellules liquides et les observations TEM in situ des interactions induites par la lumière entre les cellules bactériennes et un photosensibilisant. Les méthodes de préparation des échantillons, les dommages causés par le faisceau d’électrons et l’imagerie sont également abordés.
Abstract
Le protocole actuel décrit les modifications apportées à la configuration du microscope électronique à transmission (MET) pour les observations in situ induites par la lumière. Une fibre optique de verre insérée dans la colonne d’électrons au-dessus du pôle de l’objectif et un laser, une source de lumière réglable, ont été utilisés pour fabriquer le dispositif. Une fois l’illuminateur étalonné à l’aide d’un système de mesure externe, il permet d’ajuster l’intensité de l’éclairage aux besoins du processus observé. Ce système d’éclairage a été utilisé pour imager les phénomènes de thérapie photodynamique antimicrobienne, qui font actuellement l’objet d’intenses recherches. L’échantillon a été préparé en repérant une suspension de bactéries sur un substrat de carbone, de graphène ou de nitrure de silicium, en buvant la solution excédentaire, en repérant la solution photosensibilisante, en buvant à nouveau l’excès de liquide, puis en assemblant la cellule liquide avec un deuxième substrat ou film de graphène. Le processus de l’expérience d’imagerie elle-même comprend le choix du bon endroit pour l’observation avec l’utilisation d’un faible grossissement et d’une dose minimale d’électrons, puis l’activation cyclique de la source lumineuse pour capturer les images suivantes à des intervalles spécifiés avec le minimum d’électrons nécessaire. La dose d’électrons de chaque exposition ainsi que le temps et l’intensité de l’éclairage utilisé doivent être soigneusement enregistrés en raison de la complexité des phénomènes observés car, en même temps, le processus est à la fois entraîné par la lumière et par les électrons. Une fois l’expérience proprement dite, des observations de contrôle supplémentaires doivent être faites, dans lesquelles les mêmes doses d’électrons sont utilisées mais sans influence lumineuse supplémentaire et de plus petites doses d’électrons sont utilisées pour des doses plus élevées de lumière. Cela permet de distinguer les effets microstructuraux induits par la lumière de ceux causés par les électrons dans les domaines de la vie et de la science des matériaux.
Introduction
Les phénomènes induits par la lumière en haute résolution sont intéressants dans de nombreux domaines tels que la nanotechnique 1,2,3, la catalyse 4,5 et la biophotonique6. Certains modèles originaux qui permettent de telles expériences peuvent être trouvés dans la littérature, y compris les modifications des porte-échantillons 1,4,7,8,9 et de la fibre optique fixée au microscope 10,11.
La combinaison de l’éclairage lumineux, d’un environnement liquide et de la microscopie électronique à transmission (MET) offre une excellente occasion d’étudier en détail et dynamiquement les processus photo-induits. Cependant, la condition de vide poussé à l’intérieur du microscope est plutôt défavorable pour de nombreux liquides, en particulier les solutions aqueuses. L’encapsulation liquide, qui le protège de l’environnement, peut être réalisée à l’aide de quelques techniques basées principalement sur des substrats de graphène12, de nitrure de silicium 13 ou de carbone14. En plus de la recherche en science des matériaux2, les cellules dites liquides offrent des possibilités pour effectuer des observations microscopiques non conventionnelles sur des spécimens biologiques proches de leurs conditions natives15. De telles observations sont extrêmement exigeantes, en particulier pour les micro-organismes vivants tels que les cellules bactériennes. Le faisceau d’électrons en tant que rayonnement ionisant provoque des dommages irréversibles aux échantillons hydratés, de sorte que la dose d’électrons doit être spécifiée16. Cela est nécessaire pour minimiser les effets défavorables, contrôler les dommages et éviter les artefacts confus. La dose maximale optimale d’électrons qui permet d’observer les cellules vivantes est encore un sujet discutable16, mais la dose de 30 e−/nm2 semble être la valeur seuil, du moins pour les bactéries17.
Certains des sujets d’intérêt pour de telles études microscopiques sont les processus au cours de la thérapie photodynamique antimicrobienne (APDT)18. En bref, la thérapie se déroule comme suit. Les cellules bactériennes sont entourées par le liquide photosensible appelé photosensibilisant. Lorsque l’éclairage lumineux est donné à une longueur d’onde spécifique, les espèces réactives cytotoxiques de l’oxygène (ROS) sont générées par transfert d’énergie ou de charge des molécules photosensibilisatrices excitées à l’oxygène naturellement présent dans la solution. Les agents pathogènes exposés aux ROS sont rapidement inactivés avec une très grande efficacité, sans effets secondaires19. La réponse à la thérapie varie pour des microbes distincts – par exemple, l’impact du même photosensibilisateur peut être très différent pour les bactéries à Gram positif et à Gram négatif20. En général, il a été établi que la cible principale des ROS est les structures externes des cellules, où les dommages entraînent des troubles fonctionnels de la membrane cellulaire et, par conséquent, conduisent à la mort des bactéries21,22. Cependant, les dommages aux acides nucléiques et aux protéines peuvent également être considérés comme une cause d’inactivation18, de sorte qu’on ne sait toujours pas quelles structures cellulaires sont les principales cibles au cours de ce processus19. Une meilleure compréhension des processus dommageables pourrait aider à améliorer cette thérapie définitive. Par rapport aux méthodes de microscopie optique utilisées dans la recherche APDT23, les techniques TEM offrent plus de possibilités d’examiner le mécanisme APDT avec une résolution et un grossissementplus élevés 24. La TEM a déjà été utilisée avec succès pour l’observation cellulaire au cours du traitement en cours, ce qui nous a permis d’étudier les dommages bactériens à Gram positif et de décrire en détail les changements qui se produisent dans la paroi cellulaire 6,25.
Le protocole actuel présente une configuration expérimentale appropriée pour l’imagerie à haute résolution de l’inactivation des bactéries induite par la lumière à l’aide de la MET, ce qui nécessite un système d’éclairage lumineux approprié, l’encapsulation des cellules avec un liquide et un contrôle strict de la dose d’électrons. La bactérie utilisée pour l’observation était Staphylococcus aureus, et une solution de bleu de méthylène a été utilisée comme photosensibilisant. La configuration spéciale d’éclairage lumineux comprend un laser à semi-conducteur accordable connecté directement à la colonne du microscope à l’aide de la fibre lumineuse. Cette conception assure une irradiation uniforme dans tout l’échantillon en raison du placement presque parallèle de la fibre optique à l’axe du microscope. La lumière monochromatique de haute intensité générée par le laser peut ensuite être utilisée pour étudier divers effets photochimiques. La lumière utilisée dans l’expérience avait une longueur d’onde égale à 660 nm car, dans la région visible, le bleu de méthylène a des pics d’absorption à 613 nm et 664 nm26. Le protocole d’encapsulation liquide est basé sur des substrats de carbone, ce qui rend la procédure rapide et simple. Enfin, une méthode d’observation TEM in situ à faible dose de cellules dans un liquide est présentée. Les difficultés concernant la préparation de l’échantillon, les effets de la dose d’électrons sur l’échantillon sensible et l’interprétation raisonnable de l’image sont discutés.
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Protocol
1. Modification du microscope électronique à transmission
- Modifier le microscope électronique à transmission en connectant la fibre optique (voir Tableau des matériaux) à la colonne du microscope en haut de la lentille de l’objectif. Prévoyez quelques centimètres d’espace entre l’objectif et la lentille du condensateur, ainsi qu’un emplacement libre pour les accessoires.
NOTE: Un porte-échantillondédié 4 ou un support pour les observations cathodoluminescentes en configuration inverse1 peut également être utilisé. - Vérifiez que le système ne fuit pas à l’aide de pompes à vide rugueuses. Si le système ne présente pas de fuite de vide, testez-le sous vide poussé.
- Vérifiez que l’actionnement du système de vide ne s’écarte pas du démarrage standard du microscope ventilé. En cas de problèmes d’exécution, d’assemblage ou de mise en service du module, contactez le personnel de service autorisé ou le fabricant de l’appareil.
REMARQUE: L’illuminateur correctement conçu et monté ne masquera pas le faisceau d’électrons. Si le faisceau se déplace successivement au cours du fonctionnement du microscope, la fibre optique non conductrice ne sera pas suffisamment recouverte d’un blindage métallique et accumulera une charge électrique. Dans ce cas, faites glisser la fibre optique profondément dans la gaine conductrice.
- Vérifiez que l’actionnement du système de vide ne s’écarte pas du démarrage standard du microscope ventilé. En cas de problèmes d’exécution, d’assemblage ou de mise en service du module, contactez le personnel de service autorisé ou le fabricant de l’appareil.
- Mesurez l’intensité lumineuse à l’aide du capteur de puissance à photodiode (voir le tableau des matériaux). Si l’espace entre les pôles de la lentille de l’objectif ne permet pas la mesure à l’intérieur du microscope, mesurer la géométrie de l’échantillon et de l’illuminateur et reproduire ces conditions dans une installation de mesure externe.
- Si le microscope n’est pas équipé d’un système de mesure de dose d’électrons, effectuer l’étalonnage en mesurant le courant du faisceau avec une coupelle de Faraday (voir Tableau des matériaux) et en calculant numériquement la densité des électrons frappant l’échantillon27.
2. Encapsulation des bactéries avec le photosensibilisant
- Placer deux grilles TEM non traitées recouvertes de carbone amorphe entre deux pinces croisées orientées vers le haut du côté recouvert de carbone. Tenez les grilles aussi près du bord que possible.
NOTE: Pour certaines combinaisons de substrat, de solution et d’échantillon, il peut être avantageux d’utiliser un écoulement luminescent sur un ou les deux mailles pour éliminer les impuretés d’usine et obtenir une surface hydrophile maximale28. En utilisant l’exemple de la bactérie S. aureus et de la solution de bleu de méthylène, il a été déterminé que les résultats les meilleurs et les plus reproductibles ont été obtenus sur du carbone neuf non traité sur des grilles en cuivre sans décharge luminescente supplémentaire ni nettoyage au plasma6. - Mettez 4 μL de solution bactérienne sur l’une des grilles. La densité optique de l’échantillon doit être comprise entre 5 et 10.
REMARQUE: Les bactéries utilisées dans l’étude ont été purifiées de la culture et dispersées dans un tampon PBS. Il est fortement recommandé de vérifier la concentration de bactéries dans l’échantillon frais chaque fois qu’il l’utilise, par exemple en utilisant des méthodes de coloration négative, en suivant les protocoles établis disponibles 29,30,31. - Attendez 60 s et épongez soigneusement le liquide à l’aide de papier filtre. Essayez de répandre le liquide sur toute la surface de la grille pendant ce processus.
- Mettez 4 μL de photosensibilisant sur la même grille.
REMARQUE : Le bleu de méthylène à une concentration de 2 μg/mL a été utilisé comme photosensibilisant pour la présente étude. - Après 5 s, éponger le liquide. Laissez une très fine couche de liquide sur le substrat.
- Placez rapidement la grille sèche sur celle recouverte de liquide.
- Déplacez doucement la grille supérieure vers le bord de la seconde et pressez les substrats sur les bords à l’aide d’une pince à épiler.
REMARQUE: Un peu de liquide peut s’écouler de l’échantillon à ce stade, ce qui signifie qu’il n’y en a pas eu assez qui a été drainé. Cependant, cela ne signifie pas nécessairement que la formation de la cellule liquide échouera. - Répétez soigneusement la pression.
REMARQUE: Il est plus facile d’effectuer cette étape en tournant les pincettes de 90° de sorte qu’elles soient perpendiculaires à la table et que les extrémités des deux pincettes restent à la même hauteur, sans dépendre de la position d’ouverture / fermeture. - Laissez la cellule liquide entre les pinces à épiler pendant 1 min.
- Insérez l’échantillon dans le support TEM juste après avoir terminé la préparation.
REMARQUE: La tension de la plaque / bague de montage du support aidera les substrats à adhérer et à garder le liquide à l’intérieur.- Si possible, pompez le porte-échantillon dans une station de pompage externe pour réduire la contamination du microscope par évaporation du liquide.
3. Observations TEM in situ de cellules bactériennes dans l’effet de dose liquide-électron
- Insérez l’échantillon dans le microscope.
- Démarrez les observations en mode de faible grossissement pour trouver une zone d’observation appropriée.
REMARQUE: Les zones plus sombres sont plus susceptibles d’être liquides en raison de la diffusion par faisceau d’électrons.- Pendant les observations, maintenez la dose d’électrons aussi faible que possible. Augmenter le temps d’exposition (jusqu’à 2 s pour une tension d’accélération de 150 kV et un grossissement de 5 000x). Le grossissement de 5 000x pour la caméra à montage inférieur (le champ de vision approximatif est de 10 μm) est suffisant pour imager les bactéries d’un diamètre de ~1 μm.
REMARQUE: Parfois, il n’est pas facile de distinguer le liquide, donc, au début des observations, il est utile de concentrer le faisceau d’électrons là où il est susceptible d’être liquide. Le liquide devrait se déplacer sur un faisceau d’électrons focalisés, et les bulles apparaîtront. Après cette vérification, il est nécessaire de trouver une autre zone pour d’autres observations.
- Pendant les observations, maintenez la dose d’électrons aussi faible que possible. Augmenter le temps d’exposition (jusqu’à 2 s pour une tension d’accélération de 150 kV et un grossissement de 5 000x). Le grossissement de 5 000x pour la caméra à montage inférieur (le champ de vision approximatif est de 10 μm) est suffisant pour imager les bactéries d’un diamètre de ~1 μm.
- Trouvez les cellules entourées de liquide au grossissement approprié avec un temps d’exposition prolongé et capturez immédiatement la première image. Maintenez la dose d’électrons constante et collectez des images toutes les 30 s pour observer les changements.
- Examinez attentivement les images et calculez la dose totale d’électrons27 qui correspond aux premiers changements visibles dans les cellules.
4. Observations TEM in situ des processus induits par la lumière entre les cellules bactériennes et le photosensibilisateur
- Avant de commencer l’expérience, réglez l’intensité de la lumière laser en ajustant la valeur actuelle. Choisissez la longueur d’onde appropriée en fonction du spectre d’absorption du photosensibilisant. Selon le tracé d’étalonnage précédent (étape 1.4.), choisissez la valeur actuelle correspondant à l’intensité lumineuse la plus faible.
NOTE: La longueur d’onde lumineuse utilisée dans cette étude était de 660 nm. - Insérez l’échantillon dans le microscope et trouvez la zone d’observation après l’étape 3.2. dans la section précédente.
- Capturez la première image de la cellule avant de commencer l’éclairage de l’échantillon et utilisez l’occulteur de faisceau pour éteindre le faisceau d’électrons afin d’éviter les effets de l’irradiation électronique.
- Allumez le laser. Commencez par un temps d’éclairage court (ici 30 s) car la lumière laser a une intensité relativement élevée. Après ce temps, éteignez la source lumineuse.
- Éteignez l’occulteur de faisceau et capturez l’image immédiatement. Si possible, utilisez un algorithme automatique pour exposer l’échantillon uniquement pendant le temps nécessaire à la prise de l’image. Mesurer soigneusement le temps d’irradiation électronique pour calculer la dose d’électrons27 utilisée pour l’imagerie.
- Répétez l’étape 4.4. et étape 4.5. pour obtenir le temps d’éclairage attendu.
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Representative Results
La configuration expérimentale a été conçue pour observer les processus induits par la lumière se produisant dans un liquide à haute résolution. L’analyse concurrentielle des images nous a permis de distinguer les dommages causés par le faisceau d’électrons des changements liés à la réaction photochimique. L’effet du faisceau d’électrons sur l’échantillon sensible (dans ce cas, les cellules encapsulées avec du liquide) était visible dans toute la zone irradiée lorsque les électrons la traversaient uniformément. Bien sûr, l’effet dépend de la dose d’électrons, de sorte que des changements plus significatifs dans la morphologie de l’échantillon peuvent être observés plus rapidement pour un faisceau plus focalisé. Par rapport à ces dommages graves, les effets destructeurs réels de l’inactivation photodynamique se sont produits dans des parties spécifiques des cellules uniquement dans les zones entourées par le photosensibilisateur éclairé.
Dans l’exemple de l’imagerie bactérienne, et selon la littérature, la dose de 30 e−/nm2 semble être la valeur seuil létale pour la bactérie17, qui a été largement dépassée dans les études précédentes des auteurs 6,25. Cependant, les changements visibles dans la cellule n’ont pas été remarqués avant d’atteindre la dose électronique de 6000 e−/nm2. Les résultats ont montré une dégradation notable de la couche externe de la cellule causée par les espèces réactives de l’oxygène générées par l’irradiation lumineuse du photosensibilisateur après 1 min (Figure 1). Un éclairage lumineux supplémentaire a rendu les changements plus visibles (Figure 1D,G).
L’encapsulation des cellules entre les substrats carbonés était suffisante pour effectuer des observations constantes pendant au moins 1 h. Des points d’observation appropriés avec suffisamment de liquide peuvent être facilement trouvés à faible grossissement, car ces zones apparaissent plus sombres et floues (indiquées par les images de la figure 2A). Les bactéries couvertes de liquide sont moins visibles que les bactéries sèches, mais peuvent tout de même être distinguées (Figure 2B). Il est utile d’examiner la limite du liquide pendant l’imagerie, et son mouvement peut être facilement détecté, ce qui implique que la zone choisie peut être inappropriée et instable (Figure 3). Un autre problème lors des observations est l’évaporation de l’eau et la précipitation de la solution, qui peuvent se produire dans des zones aléatoires de l’échantillon, y compris les zones entourant la bactérie (Figure 3B,C).
Figure 1 : Résultats exemplaires du traitement photodynamique des bactéries. (A) Le schéma de la cellule liquide contenant des cellules bactériennes et du bleu de méthylène. (B) La cellule avant l’éclairage lumineux. (C) La cellule après l’éclairage pendant 1 min. (D) La cellule après l’éclairage pendant 10 min. (E-G) Les zones agrandies de (B-D). La dose d’électrons était égale à 1600 e−/nm 2, 2500 e−/nm 2 et 6000 e−/nm 2, respectivement. La figure est reproduite à partir de Żak et al.25. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Images TEM de S. aureus encapsulées avec du bleu de méthylène entre deux films de carbone. (A) L’image à faible grossissement présente à la fois des zones avec une grande quantité de liquide (indiquée par les cadres jaunes) et des taches sèches. Un examen rapide de l’échantillon à ce grossissement permet de savoir si l’encapsulation a réussi ou non. (B) La limite liquide est clairement visible dans la zone agrandie et les bactéries recouvertes du photosensibilisant peuvent être distinguées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Images TEM des effets défavorables pouvant survenir pendant l’imagerie. (A) Au début, la cellule était uniformément entourée par le liquide, qui couvrait la majeure partie de la zone d’observation. (B) Sur la base de l’irradiation constante par faisceau d’électrons, le mouvement et l’évaporation du liquide et le début de la précipitation de la solution peuvent être remarqués. (C) La poursuite des processus entraîne des mouvements irréversibles, un moussage et une désintégration du photosensibilisant, rendant impossible toute observation ultérieure. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Les effets défavorables conduisant à des conclusions erronées. (A) Le liquide cristallisé. (B) La contamination s’est installée sur la cellule. (C) Moussage causé par le faisceau d’électrons. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
L’installation et la mise en service de l’illuminateur nécessitent des connaissances de base en matière de service et peuvent endommager le microscope. La façon la plus simple d’introduire la lumière dans le microscope est de connecter la fibre optique à partir du haut de la lentille de l’objectif, où il y a généralement de la place pour les bobines de déviation TEM et les détecteurs supplémentaires. On peut également s’attendre à plus d’espace libre avec les anciens dispositifs d’entrée par le haut, où le même emplacement abrite le verrou à vide de l’échantillon et le mécanisme d’installation de l’échantillon. Cette configuration est largement décrite dans un précédent rapport25, qui contient un exemple de conception d’illuminateur. Si l’intérieur du microscope ne permet pas l’installation de la fibre optique au-dessus de la lentille de l’objectif, l’illuminateur peut être installé à l’intérieur du pôle de la lentille de l’objectif par le côté32. D’autres solutions supposent l’utilisation d’un porte-échantillon dédié4 ou l’utilisation inverse du support pour les observations cathodoluminescentes1.
En général, la préparation d’échantillons liquides pour la GDT est compliquée et nécessite de l’expérience et des compétences manuelles. L’étape critique de la préparation des cellules liquides est l’étape 2.6. du protocole. Il est important de placer la deuxième grille rapidement pour éviter l’évaporation du liquide. La méthode présentée ici est simple et ne nécessite pas de matériaux inhabituels; Cependant, il pourrait ne pas convenir à tous les liquides. Dans certains cas, il est bénéfique de nettoyer le substrat avec du plasma pour augmenter son hydrophilie. Pour les échantillons liquides, en particulier les solutions aqueuses, qui ne contiennent pas de particules et/ou de cellules qui pourraient servir d’espaceur entre les films de carbone, l’encapsulation peut échouer car tout le liquide peut s’écouler entre les surfaces planes. L’utilisation d’une cellule liquide de graphène préparée à l’aide d’un substrat troué, qui crée de petites « poches » pour le liquide, pourrait être plus appropriée33.
Les observations TEM effectuées dans un liquide peuvent être perturbées par quelques facteurs liés à la préparation de l’échantillon et aux effets défavorables causés par le faisceau d’électrons. Le premier comprend le détachement des substrats et le mouvement du liquide, souvent suivi de la rupture du film de carbone, qui se produit pour des volumes liquides élevés dans la zone et/ou lors de l’irradiation électronique. Cela peut être évité en minimisant le volume de liquide à l’étape 2.5. du protocole.
L’irradiation avec des électrons hautement énergétiques conduit à un transfert d’énergie, entraînant un chauffage ou une radiolyse. Après interaction avec le rayonnement, l’eau se décompose en radicaux (H· et OH·), H2 et électrons solvatés. Ces espèces participent à d’autres réactions, générant ainsi différents produits et causant des dommages à l’échantillon34. Par conséquent, il est très important de maintenir la dose d’électrons faible pendant les observations (étape 3.2.), en particulier pour les échantillons sensibles comme les cellules. D’autres effets causés par le faisceau d’électrons sont la précipitation de la solution (Figure 4A) et la formation de mousse du liquide (Figure 4C). Réduire la dose d’électrons permet d’éviter ces deux effets négatifs, mais parfois il n’est pas possible de les éliminer. Il peut également y avoir une certaine contamination sensible aux rayonnements dans la solution, qui se dépose sur la cellule (Figure 4B) et change sous l’influence du faisceau d’électrons. Ceci est défavorable car l’impureté pourrait être prise dans le cadre de la cellule, qui est endommagée lors de l’irradiation lumineuse, conduisant à des conclusions erronées. La meilleure façon d’obtenir des images fiables est de trouver une zone non contaminée et de maintenir la dose d’électrons aussi faible que possible.
Des études TEM in situ fiables des photoréactions nécessitent une bonne comparaison entre les processus induits par la lumière et ceux provoqués par le faisceau d’électrons. À l’exception de la réduction de la dose d’électrons décrite à l’étape 3.2., il est utile d’éteindre la source d’électrons pendant la durée de l’éclairage de la lumière afin que les résultats non perturbés puissent être observés, comme souligné à l’étape 4.3. du protocole.
Le présent protocole peut être utilisé pour observer les réactions induites par la lumière (en particulier dans les liquides), par exemple, la lumière sur les nanoclusters métalliques2, les processus de catalyse induits par la lumière1 et l’influence de la lumière sur des échantillons biologiques (par exemple, les cellules avec un photosensibilisant, les chloroplastes).
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
La recherche a été financée par la subvention Miniatura (2019/03/X/NZ3/02100, Centre national des sciences, Pologne).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carbon film on 200 mesh copper grid | Agar Scientific | AGS160 | The standard TEM grids for observations and liquid cell preparation |
| Crossover Tweezers | Dumont | N5 | The tweezers are neecesarry for liquid cell preparation |
| Photodiode Power Sensor | ThorLabs | S130C | The sensor used for light intensity measurement |
| Polyimide-Coated Multimode Fiber | Thorlabs | FG400UEP | Must be built into the microscope using the on-site built adapter, according to the 10.1016/j.ultramic.2021.113388 |
| Transmission Electron Microscope | Hitachi | H-800 | Can be replaced with any side-entry microscope, available for modification |
| Tuneable Diode Laser | CNI | MRL-III-660D | The light wavelength must be chosen basing on photosensitizer's absorption spectrum |
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