Intravitreale Injektionen in das Schafauge

Summary

Intravitreale Injektionen wurden im Schafauge mit dem Ziel durchgeführt, eine viral vermittelte Gentherapie an die Netzhaut zu verabreichen.

Abstract

Es gibt mehrere Methoden für die Abgabe von Therapeutika an die Netzhaut, einschließlich intravitrealer (IVT), subretinaler, suprachoroidaler, periokularer oder topischer Verabreichung. IVT Medikamentenabgabe beinhaltet eine Injektion in den Glaskörper des Auges, eine gallertartige Substanz, die die hintere Augenkammer füllt und die Form der Augenkugel beibehält. Obwohl der IVT-Weg weniger spezifisch ausgerichtet ist als die subretinale Abgabe, ist er viel weniger invasiv und wird häufig in klinischen Umgebungen für eine Reihe von Augenerkrankungen eingesetzt.

Wir haben zuvor die Wirksamkeit der intravitrealen Verabreichung eines Adeno-assoziierten Virus (AAV)-vermittelten Gentherapieprodukts (AAV9) nachgewiesen. CLN5) bei Schafen mit einer natürlich vorkommenden CLN5-Form der neuronalen Ceroid-Lipofuszinose (NCL). Betroffene Schafe erhielten eine IVT-Gentherapie auf einem Auge, wobei das andere unbehandelte Auge als interne Kontrolle diente. Die Netzhautstruktur und -funktion blieb im behandelten Auge bis zu 15 Monate nach der Behandlung erhalten, während das unbehandelte Auge während der postmortalen Untersuchung eine zunehmend abnehmende Funktion und eine schwere Atrophie zeigte. Basierend auf den Schafstudien wurde das Gentherapieprodukt CLN5 im September 2021 von der US-amerikanischen Food and Drug Administration als Kandidat für ein neues Prüfpräparat (IND) zugelassen. Dieser Artikel beschreibt das chirurgische Protokoll für die IVT-Verabreichung eines therapeutischen viralen Vektors an das Schafauge.

Introduction

Mehrere Methoden können verwendet werden, um Therapeutika an die Netzhaut abzugeben, einschließlich intravitrealer (IVT), subretinaler, suprachoroidaler, periokularer oder topischer Verabreichung. Jeder Verabreichungsweg beinhaltet die Überwindung von Barrieren wie der Blut-Netzhaut-Schranke oder den inneren und äußeren Begrenzungsmembranen und hat je nach verabreichtem Arzneimittel und spezifischem Netzhautziel^{unterschiedliche} Wirksamkeitsraten ^1,2.

IVT Medikamentenabgabe beinhaltet eine Injektion in den Glaskörper des Auges, eine gallertartige Substanz, die die hintere Augenkammer besetzt. Die Hauptfunktion des Glaskörpers besteht darin, die Form der Augenkugel zu erhalten und Augengewebe wie Linse und Netzhaut an Ort und Stelle zu halten. Der Glaskörper besteht größtenteils aus Wasser, mit geringen Mengen an Kollagen, Hyaluronsäure und anderen nicht-kollagenen Proteinen³. Die IVT-Injektion ist ein einfaches und gebräuchliches Verfahren, das routinemäßig zur Behandlung einer Vielzahl von Augenerkrankungen angewendet wird, einschließlich altersbedingter Makuladegeneration, diabetischer Makulaödeme, diabetischer Retinopathie, Netzhautvenenverschluss und mehrerer erblicher Netzhautdystrophien ^4,5.

Neuronale Ceroid-Lipofuszinosen (NCL; Batten-Krankheit) sind eine Gruppe von tödlichen lysosomalen Speicherkrankheiten, die eine schwere Degeneration des Gehirns und der Netzhaut verursachen. Derzeit sind 13 Varianten von NCL bekannt, die aus Mutationen in verschiedenen Genen (CLN1-8, CLN10-14) resultieren, die überwiegend Kinder betreffen, aber unterschiedliches Erkrankungsalter und Krankheitsschweregrad⁶ aufweisen. Die NCLs teilen gemeinsame progressive Symptome, einschließlich kognitivem und motorischem Verfall, Krampfanfällen und Sehverlust. Es gibt keine Heilung für NCL; Die gehirngesteuerte Enzymersatztherapie befindet sich jedoch derzeit in klinischen Studien für die CLN2-Krankheit^7,8, und die AAV-vermittelte Gentherapie hat sich in präklinischen Studien als vielversprechend erwiesen, wobei eine klinische Studie für die CLN5-Gentherapie voraussichtlich 2022 beginnen wird ^9,10.

Viele andere Arten entwickeln natürlich vorkommende Formen von NCL, einschließlich Katzen, Hunde, Schafe und Kühe. Zwei NCL-Schafmodelle werden derzeit in Neuseeland aktiv untersucht: ein CLN5-Krankheitsmodell bei Borderdale-Schafen und ein CLN6-Krankheitsmodell bei Schafen in South Hampshire. Betroffene Schafe weisen viele der klinischen und pathologischen Merkmale der menschlichen Krankheit auf, einschließlich Netzhautatrophie und Sehverlust^10,11. Obwohl die gehirngesteuerte CLN5-Gentherapie bei Schafen mit CLN5-Krankheit Hirnatrophie und klinischen Verfall verhindern oder stoppen kann, verlieren die behandelten Schafe immer noch ihr^{Sehvermögen 9}. Dies unterstrich die Notwendigkeit, die Netzhaut zu behandeln, um das Sehvermögen zu erhalten und eine bessere Lebensqualität zu erhalten, was zur Erstellung eines Protokolls für die Augengentherapie bei Schafen führte.

Das Schafauge stellt aufgrund seiner Ähnlichkeit in den Augenkugelabmessungen, dem Glaskörper und der Netzhautstruktur^10,12,13 ein gutes Modell des menschlichen Auges dar. Dieser Artikel beschreibt das chirurgische Protokoll für die IVT-Abgabe eines kleinen Volumens (≤100 μL) therapeutischen viralen Vektors an das Schafauge.

Protocol

Alle experimentellen Protokolle wurden vom Lincoln University Animal Ethics Committee genehmigt und entsprechen den Richtlinien der US National Institutes of Health für die Pflege und Verwendung von Tieren in der Forschung und dem New Zealand Animal Welfare Act (1999). Borderdale-Schafe wurden bei der Geburt14 diagnostiziert und auf Forschungsfarmen der Lincoln University gepflegt. Drei 3 Monate alte homozygote (CLN5-/-) Mutterschafe erhielten eine einzige IVT-Injektion in das linke Au…

Representative Results

Die Wirksamkeit der IVT-Verabreichung eines CLN5-Gentherapievektors bei der Abschwächung von Netzhautdysfunktion und Degeneration bei Schafen mit CLN5 NCL wurde bereits von dieser Forschungsgruppe15 nachgewiesen. Die betroffenen Schafe erhielten eine einmalige 100 μL IVT-Injektion von CLN5, verpackt in einem AAV-Serotyp 9 (AAV9) Vektor (AAV9). CLN5) in ein Auge, wobei das kontralaterale Auge als unbehandelte innere Kontrolle dient. Das Sehvermögen wurde monatlich vom Injektionsalter (3 Monate) …

Discussion

Intravitreale Injektionen sind eines der häufigsten chirurgischen Verfahren in der menschlichen Ophthalmologie und haben sich bei der Verabreichung von AAV-vermittelten Gentherapien an die Netzhaut von Schafen als wirksam erwiesen. Wir hatten zuvor die Wirksamkeit von AAV9 nachgewiesen. Die CLN5-Gentherapie führte intravitreal zur Abschwächung von Netzhautdysfunktion und Degeneration bei Schafen mit CLN5 NCL¹⁵. Es ist zu hoffen, dass sich auch die Übertragung dieses Verabreichungsweges an mens…

Materials

1 mL low dead-space safety syringe with permanently attached 0.5 inch needle	Fisher Scientific, Auckland, New Zealand	05-561-28	Covidien Monoject Tuberculin Safety syringe or similar
1.5 mL microcentrifuge tube	Sigma Aldrich	HS4323	Autoclave tubes to sterilise prior to use
Anesthesia machine with gas bench and monitor	Hyvet Anesthesia, Christchurch, New Zealand
Antibiotic eye drops	Teva Pharma Ltd, Auckland, New Zealand		Commercial name: Chlorafast (0.5% chloramphenicol)
BrightMount plus anti-fade mounting medium	Abcam, Cambridge, United Kingdom	ab103748
DAPI (4′ ,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)	Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, United States	10236276001
Diazepam sedative	Ilium, Troy Laboratories Pty Ltd, Tauranga, New Zealand		5 mg/mL
Endotracheal tubes	Flexicare Medical Ltd, Mountain Ash, United Kingdom		Standard, cuffed. Sizes 7, 7.5, or 8 depending on sheep size
Eye speculum	Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand	KP151/14	Nopa Barraquer-Colibri (10 mm)
Fenestrated surgical drape	Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand	DI583	Or similar
Filter Tips	Interlab, Auckland, New Zealand		10, 200, and 1,000 µL
Formaldehyde solution (37%)	Fisher Scientific, Auckland, New Zealand	AJA809-2.5PL	Make up to 10% in distilled water with 0.9% NaCl
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 594	Invitrogen Carlsbad, CA, USA	A-11012	Use at a dilution of 1:500
Isoflurane anesthetic	Attane, Bayer Animal Health, Auckland, New Zealand
Ketamine HCl anesthetic/analgesic	PhoenixPharm Distributors Ltd, Auckland, New Zealand		100 mg/mL
Laryngoscope (veterinary)	KaWe Medical, Denmark		Miller C blade, size 2
Needles	Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand	302025	BD Hypodermic Needles, or similar
Non-steroidal anti-inflammatory	Boehringer Ingelheim (NZ) Ltd, Auckland, New Zealand	49402/008	Commercial name: Metacam 20 (20 mg/mL meloxicam)
Non-toothed forceps	Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand	AB864/16	Or similar
Non-toothed hemostat	Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand	AA150/12	Or similar
Normal goat serum	Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand	16210072
Oxygen (medical)	BOC Gas, Christchurch, New Zealand		D2 cylinder, gas code 180
Phosphate buffered saline	Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand	10010023	Sterile, filtered
Povidone-Iodine solution	Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand	005835	Commercial name: Betadine (10% povidone-iodine)
Rabbit anti-cow glial fibrillary acidic protein (GFAP)	Dako, Glostrup, Denmark	Z0334	Use at a dilution of 1:2,500
Self-complementary adeno-associated virus serotype 9, containing the chicken beta action (CBh) promoter and codon-optimized ovine CLN5	University of North Carolina Vector Core, NC, USA.	scAAV9/CBh-oCLN5opt
Sodium Chloride 0.9% IV Solution	Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand	AHB1322	Commercial name: Saline solution
Subcutaneous antibiotics	Intervet Schering Plough Animal Health Ltd, Wellington, New Zealand		Commercial name: Duplocillin LA (150,000 IU/mL procaine penicillin and 115,000 IU/mL benzathine penicillin)
Surgical sharp blunt curved scissors	Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand	SSSHBLC130
Terumo Syringe Luer Lock	Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand	SH159/SH160	Sterile syringes; 10 mL for drawing up induction drugs, 20 mL for drawing up saline
Virkon Disinfectant Powder	EBOS Group Ltd, Christchurch, NZ	28461115