Интравитреальные инъекции в ячий глаз
Summary
Интравитреальные инъекции проводились в овечий глаз с целью доставки вирусно-опосредованной генной терапии к сетчатке.
Abstract
Существует несколько методов доставки терапевтических средств к сетчатке, включая интравитреальное (IVT), субретинальное, супрахориоидальное, периокулярное или местное введение. Доставка препарата IVT включает инъекцию в стекловидное тело глаза, желатиновое вещество, которое заполняет заднюю камеру глаза и поддерживает форму глазного шара. Хотя путь IVT менее специфичен, чем субретинальная доставка, он гораздо менее инвазивный и широко используется в клинических условиях для ряда глазных заболеваний.
Ранее мы продемонстрировали эффективность интравитреальной доставки продукта генной терапии, опосредованного аденоассоциированным вирусом (AAV) (AAV9. CLN5) у овец с естественной формой CLN5 нейронального цероидного липофусциноза (NCL). Пораженные овцы получали генную терапию IVT в одном глазу, а другой необработанный глаз служил внутренним контролем. Структура и функция сетчатки сохранялись в обработанном глазу в течение 15 месяцев после лечения, в то время как необработанный глаз демонстрировал прогрессирующее снижение функции и тяжелую атрофию во время патологоанатомического исследования. Основываясь на исследованиях на овцах, продукт генной терапии CLN5 был одобрен в качестве кандидата в исследуемые новые препараты (IND) Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США в сентябре 2021 года. В этой статье подробно описывается хирургический протокол доставки IVT терапевтического вирусного вектора в овечий глаз.
Introduction
Несколько методов могут быть использованы для доставки терапевтических агентов к сетчатке, включая интравитреальное (IVT), субретинальное, супрахороидальное, периокулярное или местное введение. Каждый путь введения включает преодоление барьеров, таких как барьер крови-сетчатки или внутренняя и внешняя ограничивающие мембраны, и имеет различные показатели эффективности в зависимости от доставляемого препарата и конкретной мишенисетчатки 1,2.
Доставка препарата IVT включает инъекцию в стекловидное тело глаза, студенистое вещество, которое занимает заднюю камеру глаза. Основная функция стекловидного тела заключается в поддержании формы глазного шара и удержании глазных тканей, таких как хрусталик и сетчатка, на месте. Стекловидное тело состоит в основном из воды, с небольшим количеством коллагена, гиалуроновой кислоты и других неколлагеновых белков3. Инъекция IVT является простой и распространенной процедурой, обычно используемой для лечения широкого спектра глазных состояний, включая возрастную макулярную дегенерацию, диабетический макулярный отек, диабетическую ретинопатию, окклюзию вен сетчатки и несколько наследственных дистрофий сетчатки 4,5.
Нейрональные цероидные липофусцинозы (NCL; Болезнь Баттена) представляют собой группу смертельных лизосомальных заболеваний хранения, которые вызывают тяжелую дегенерацию мозга и сетчатки. В настоящее время известно 13 вариантов NCL, возникающих в результате мутаций в различных генах (CLN1-8, CLN10-14), которые преимущественно поражают детей, но имеют различный возраст начала и тяжесть заболевания6. НКЛ имеют общие прогрессирующие симптомы, включая когнитивное и двигательное снижение, судороги и потерю зрения. Не существует лекарства от NCL; тем не менее, ферментозаместительная терапия, направленная на мозг, в настоящее время находится в клинических испытаниях для болезни CLN2 7,8, а генная терапия, опосредованная AAV, показала большие перспективы в доклинических исследованиях, а клиническое испытание генной терапии CLN5, как ожидается, начнется в 2022 году 9,10.
Многие другие виды развивают естественные формы NCL, включая кошек, собак, овец и коров. Две модели NCL овец в настоящее время активно изучаются в Новой Зеландии: модель болезни CLN5 у овец Бордердейла и модель болезни CLN6 у овец Южного Гемпшира. Пораженные овцы проявляют многие клинические и патологические особенности заболевания человека, включая атрофию сетчатки и потерю зрения10,11. Хотя генная терапия CLN5, направленная на мозг, у овец с болезнью CLN5 может предотвратить или остановить атрофию мозга и клиническое снижение, обработанные овцы все еще теряют зрение9. Это подчеркнуло необходимость лечения сетчатки для сохранения зрения и поддержания лучшего качества жизни, что привело к созданию протокола для глазной генной терапии у овец.
Овечий глаз представляет собой хорошую модель человеческого глаза из-за его сходства в размерах глазного шара, объеме стекловидного тела иструктуре сетчатки 10,12,13. В этой статье подробно описывается хирургический протокол доставки IVT небольшого объема (≤100 мкл) терапевтического вирусного вектора в овечий глаз.
Protocol
Representative Results
Discussion
Интравитреальные инъекции являются одной из наиболее распространенных хирургических процедур в офтальмологии человека и доказали свою эффективность в доставке AAV-опосредованной генной терапии к сетчатке овец. Ранее мы продемонстрировали эффективность AAV9. Генная терапия CLN5 проводил…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить доктора Стива Хипа (BVSc, CertVOphthal) за его помощь в установлении этого протокола и выполнении инъекций, описанных Murray et al.15. Авторы также признают финансирование со стороны CureKids New Zealand, Кентерберийского фонда медицинских исследований, Neurogene Inc и Ассоциации поддержки и исследований болезни Баттена.
Materials
| 1 mL low dead-space safety syringe with permanently attached 0.5 inch needle | Fisher Scientific, Auckland, New Zealand | 05-561-28 | Covidien Monoject Tuberculin Safety syringe or similar |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sigma Aldrich | HS4323 | Autoclave tubes to sterilise prior to use |
| Anesthesia machine with gas bench and monitor | Hyvet Anesthesia, Christchurch, New Zealand | ||
| Antibiotic eye drops | Teva Pharma Ltd, Auckland, New Zealand | Commercial name: Chlorafast (0.5% chloramphenicol) | |
| BrightMount plus anti-fade mounting medium | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab103748 | |
| DAPI (4′ ,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | 10236276001 | |
| Diazepam sedative | Ilium, Troy Laboratories Pty Ltd, Tauranga, New Zealand | 5 mg/mL | |
| Endotracheal tubes | Flexicare Medical Ltd, Mountain Ash, United Kingdom | Standard, cuffed. Sizes 7, 7.5, or 8 depending on sheep size | |
| Eye speculum | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | KP151/14 | Nopa Barraquer-Colibri (10 mm) |
| Fenestrated surgical drape | Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand | DI583 | Or similar |
| Filter Tips | Interlab, Auckland, New Zealand | 10, 200, and 1,000 µL | |
| Formaldehyde solution (37%) | Fisher Scientific, Auckland, New Zealand | AJA809-2.5PL | Make up to 10% in distilled water with 0.9% NaCl |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen Carlsbad, CA, USA | A-11012 | Use at a dilution of 1:500 |
| Isoflurane anesthetic | Attane, Bayer Animal Health, Auckland, New Zealand | ||
| Ketamine HCl anesthetic/analgesic | PhoenixPharm Distributors Ltd, Auckland, New Zealand | 100 mg/mL | |
| Laryngoscope (veterinary) | KaWe Medical, Denmark | Miller C blade, size 2 | |
| Needles | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | 302025 | BD Hypodermic Needles, or similar |
| Non-steroidal anti-inflammatory | Boehringer Ingelheim (NZ) Ltd, Auckland, New Zealand | 49402/008 | Commercial name: Metacam 20 (20 mg/mL meloxicam) |
| Non-toothed forceps | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AB864/16 | Or similar |
| Non-toothed hemostat | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AA150/12 | Or similar |
| Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand | 16210072 | |
| Oxygen (medical) | BOC Gas, Christchurch, New Zealand | D2 cylinder, gas code 180 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand | 10010023 | Sterile, filtered |
| Povidone-Iodine solution | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | 005835 | Commercial name: Betadine (10% povidone-iodine) |
| Rabbit anti-cow glial fibrillary acidic protein (GFAP) | Dako, Glostrup, Denmark | Z0334 | Use at a dilution of 1:2,500 |
| Self-complementary adeno-associated virus serotype 9, containing the chicken beta action (CBh) promoter and codon-optimized ovine CLN5 | University of North Carolina Vector Core, NC, USA. | scAAV9/CBh-oCLN5opt | |
| Sodium Chloride 0.9% IV Solution | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AHB1322 | Commercial name: Saline solution |
| Subcutaneous antibiotics | Intervet Schering Plough Animal Health Ltd, Wellington, New Zealand | Commercial name: Duplocillin LA (150,000 IU/mL procaine penicillin and 115,000 IU/mL benzathine penicillin) | |
| Surgical sharp blunt curved scissors | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | SSSHBLC130 | |
| Terumo Syringe Luer Lock | Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand | SH159/SH160 | Sterile syringes; 10 mL for drawing up induction drugs, 20 mL for drawing up saline |
| Virkon Disinfectant Powder | EBOS Group Ltd, Christchurch, NZ | 28461115 |
Referências
- Himawan, E., et al. Drug delivery to retinal photoreceptors. Drug Discovery Today. 24 (8), 1637-1643 (2019).
- Murray, S. J., Mitchell, N. L. Ocular therapies for neuronal ceroid lipofuscinoses: More than meets the eye. Neural Regeneration Research. 17 (8), 1755-1756 (2022).
- Bishop, P. N. Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel. Progress in Retinal and Eye Research. 19 (3), 323-344 (2000).
- Grzybowski, A., et al. update on intravitreal injections: Euretina expert consensus recommendations. Ophthalmologica. 239 (4), 181-193 (2018).
- Pavlou, M., et al. Novel AAV capsids for intravitreal gene therapy of photoreceptor disorders. EMBO Molecular Medicine. 13 (4), 13392 (2021).
- Kousi, M., Lehesjoki, A. -. E., Mole, S. E. Update of the mutation spectrum and clinical correlations of over 360 mutations in eight genes that underlie the neuronal ceroid lipofuscinoses. Human Mutation. 33 (1), 42-63 (2012).
- Wibbeler, E., et al. Cerliponase alfa for the treatment of atypical phenotypes of CLN2 disease: A retrospective case series. Journal of Child Neurology. 36 (6), 468-474 (2021).
- Schulz, A., et al. Study of intraventricular cerliponase alfa for CLN2 disease. The New England Journal of Medicine. 378 (20), 1898-1907 (2018).
- Mitchell, N. L., et al. Longitudinal in vivo monitoring of the CNS demonstrates the efficacy of gene therapy in a sheep model of CLN5 Batten disease. Molecular Therapy. 26 (10), 2366-2378 (2018).
- Murray, S. J., Mitchell, N. L. Natural history of retinal degeneration in ovine models of CLN5 and CLN6 neuronal ceroid lipofuscinoses. Scientific Reports. 12 (1), 3670 (2022).
- Russell, K. N., Mitchell, N. L., Wellby, M. P., Barrell, G. K., Palmer, D. N. Electroretinography data from ovine models of CLN5 and CLN6 neuronal ceroid lipofuscinoses. Data in Brief. 37, 107188 (2021).
- Shafiee, A., McIntire, G. L., Sidebotham, L. C., Ward, K. W. Experimental determination and allometric prediction of vitreous volume, and retina and lens weights in Göttingen minipigs. Veterinary Ophthalmology. 11 (3), 193-196 (2008).
- Shinozaki, A., Hosaka, Y., Imagawa, T., Uehara, M. Topography of ganglion cells and photoreceptors in the sheep retina. The Journal of Comparative Neurology. 518 (12), 2305-2315 (2010).
- Frugier, T., et al. A new large animal model of CLN5 neuronal ceroid lipofuscinosis in Borderdale sheep is caused by a nucleotide substitution at a consensus splice site (c.571+1G>A) leading to excision of exon 3. Neurobiology of Disease. 29 (2), 306-315 (2008).
- Murray, S. J., et al. Intravitreal gene therapy protects against retinal dysfunction and degeneration in sheep with CLN5 Batten disease. Experimental Eye Research. 207, 108600 (2021).
- Ross, M., et al. Outer retinal transduction by AAV2-7m8 following intravitreal injection in a sheep model of CNGA3 achromatopsia. Gene Therapy. , (2021).
- Boyd, R. F., et al. Photoreceptor-targeted gene delivery using intravitreally administered AAV vectors in dogs. Gene Therapy. 23 (2), 223-230 (2016).
- Dalkara, D., et al. In vivo-directed evolution of a new adeno-associated virus for therapeutic outer retinal gene delivery from the vitreous. Science Translational Medicine. 5 (189), (2013).
- Gearhart, P. M., Gearhart, C., Thompson, D. A., Petersen-Jones, S. M. Improvement of visual performance with intravitreal administration of 9-cis-retinal in Rpe65-mutant dogs. Archives of Ophthalmology. 128 (11), 1442-1448 (2010).
- Ross, M., et al. Evaluation of photoreceptor transduction efficacy of capsid-modified adeno-associated viral vectors following intravitreal and subretinal delivery in sheep. Human Gene Therapy. 31 (13-14), 719-729 (2020).
- Kotterman, M. A., et al. Antibody neutralization poses a barrier to intravitreal adeno-associated viral vector gene delivery to non-human primates. Gene Therapy. 22 (2), 116-126 (2015).
- Whitehead, M., Osborne, A., Yu-Wai-Man, P., Martin, K. Humoral immune responses to AAV gene therapy in the ocular compartment. Biological Reviews. 96 (4), 1616-1644 (2021).
- Yun, C., Oh, J., Hwang, S. -. Y., Kim, S. -. W., Huh, K. Subconjunctival hemorrhage after intravitreal injection of anti-vascular endothelial growth factor. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (9), 1465-1470 (2015).
- Christensen, L., Cerda, A., Olson, J. L. Real-time measurement of needle forces and acute pressure changes during intravitreal injections. Clinical & Experimental Ophthalmology. 45 (8), 820-827 (2017).
- Allmendinger, A., Butt, Y. L., Mueller, C. Intraocular pressure and injection forces during intravitreal injection into enucleated porcine eyes. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 166, 87-93 (2021).
- Ross, M., Ofri, R. The future of retinal gene therapy: Evolving from subretinal to intravitreal vector delivery. Neural Regeneration Research. 16 (9), 1751-1759 (2021).
- Henein, C., et al. Hydrodynamics of intravitreal injections into liquid vitreous substitutes. Pharmaceutics. 11 (8), 371 (2019).
- Park, I., Park, H. S., Kim, H. K., Chung, W. K., Kim, K. Real-time measurement of intraocular pressure variation during automatic intravitreal injections: An ex-vivo experimental study using porcine eyes. PloS One. 16 (8), 0256344 (2021).
- Willekens, K., et al. Intravitreally injected fluid dispersion: Importance of injection technique. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (3), 1434-1441 (2017).
- Peynshaert, K., Devoldere, J., De Smedt, S. C., Remaut, K. In vitro and ex vivo models to study drug delivery barriers in the posterior segment of the eye. Advanced Drug Delivery Reviews. 126, 44-57 (2018).
- Kiss, S. Vector Considerations for Ocular Gene Therapy. Adeno-associated virus vectors offer a safe and effective tool for gene delivery. Retinal Physician. 17, 40-45 (2020).
- Kleine Holthaus, S. -. M., et al. Gene therapy targeting the inner retina rescues the retinal phenotype in a mouse model of CLN3 Batten disease. Human Gene Therapy. 31 (13-14), 709-718 (2020).
- Kleine Holthaus, S. -. M., et al. Neonatal brain-directed gene therapy rescues a mouse model of neurodegenerative CLN6 Batten disease. Human Molecular Genetics. 28 (23), 3867-3879 (2019).
