זריקות תוך-גופיות בוצעו בעין הכבשה במטרה להעביר טיפול גנטי בתיווך ויראלי לרשתית.
ישנן מספר שיטות להעברת סוכנים טיפוליים לרשתית, כולל intravitreal (IVT), subretinal, suprachoroidal, periocular, או ניהול מקומי. אספקת תרופות IVT כוללת זריקה לתוך ההומור הזגוגי של העין, חומר ג’לטיני הממלא את החדר האחורי של העין ושומר על צורת כדור הארץ. למרות שמסלול ה- IVT פחות ממוקד באופן ספציפי מאשר לידה תת-קרקעית, הוא הרבה פחות פולשני ונמצא בשימוש נרחב במסגרות קליניות למגוון מחלות עיניים.
בעבר הדגמנו את היעילות של העברה תוך-גופית של מוצר טיפול גנטי בתיווך נגיף אדנו (AAV) (AAV9). CLN5) בכבשים עם צורה טבעית של CLN5 של ליפופוסינוזיס עצבי (NCL). כבשים מושפעות קיבלו טיפול גנטי IVT בעין אחת, כאשר העין השנייה לא מטופלת משמשת כבקרה פנימית. מבנה ותפקוד הרשתית נשמרו בעין המטופלת עד 15 חודשים לאחר הטיפול, בעוד שהעין הלא מטופלת הפגינה ירידה הדרגתית בתפקוד וניוון חמור במהלך הבדיקה שלאחר המוות. בהתבסס על מחקרי הכבשים, מוצר הטיפול הגנטי CLN5 אושר כתרופה חדשה ניסיונית מועמדת (IND) על ידי מנהל המזון והתרופות של ארצות הברית בספטמבר 2021. מאמר זה מפרט את הפרוטוקול הכירורגי להעברת IVT של וקטור ויראלי טיפולי לעין הביצית.
ניתן להשתמש במספר שיטות כדי להעביר חומרים טיפוליים לרשתית, כולל intravitreal (IVT), subretinal, suprachoroidal, periocular, או ניהול מקומי. כל מסלול של מתן כרוך בהתגברות על מחסומים כגון מחסום הדם-רשתית או הממברנות המגבילות הפנימיות והחיצוניות ויש לו שיעורי יעילות משתנים בהתאם לתרופה המועברת וליעד הרשתיתהספציפי 1,2.
אספקת תרופות IVT כוללת זריקה לתוך ההומור הזגוגי של העין, חומר ג’לטיני התופס את החדר האחורי של העין. תפקידו העיקרי של ההומור הזגוגי הוא לשמור על צורת כדור הארץ של העין ולשמור על רקמות העין, כגון העדשה והרשתית, במקום. ההומור הזגוגי מורכב ברובו ממים, עם כמויות קטנות של קולגן, חומצה היאלורונית וחלבונים אחרים שאינם קולוגניים3. הזרקת IVT היא הליך פשוט ונפוץ המשמש באופן שגרתי לטיפול במגוון רחב של מחלות עיניים, כולל ניוון מקולרי תלוי גיל, בצקת מקולרית סוכרתית, רטינופתיה סוכרתית, חסימת ורידים ברשתית ומספר ניוון רשתיתתורשתי 4,5.
ליפופוסצינוזות עצביות (NCL; מחלת באטן) הן קבוצה של מחלות אחסון ליזוזומליות קטלניות הגורמות לניוון חמור של המוח והרשתית. כיום ידועות 13 גרסאות של NCL הנובעות ממוטציות בגנים שונים (CLN1-8, CLN10-14) המשפיעות בעיקר על ילדים, אך יש להן גילאים משתנים של התפרצות וחומרת המחלה6. ה-NCLs חולקים תסמינים פרוגרסיביים נפוצים, כולל ירידה קוגניטיבית ומוטורית, התקפים ואובדן ראייה. אין תרופה ל-NCL; עם זאת, טיפול בתחליפי אנזימים מוכווני מוח נמצא כיום בניסויים קליניים למחלת CLN27,8, וטיפול גנטי בתיווך AAV הראה הבטחה רבה במחקרים פרה-קליניים, כאשר ניסוי קליני לטיפול גנטי CLN5 צפוי להתחיל בשנת 2022 9,10.
מינים רבים אחרים מפתחים צורות טבעיות של NCL, כולל חתולים, כלבים, כבשים ופרות. שני מודלים של ביצות NCL נמצאים כעת במחקר פעיל בניו זילנד: מודל מחלת CLN5 בכבשי בורדרדייל ומודל מחלת CLN6 בכבשים בדרום המפשייר. כבשים מושפעות מציגות רבים מהמאפיינים הקליניים והפתולוגיים של המחלה האנושית, כולל ניוון רשתית ואובדן ראייה10,11. למרות שטיפול גנטי CLN5 מכוון מוח בכבשים עם מחלת CLN5 יכול למנוע או לעצור ניוון מוחי וירידה קלינית, הכבשים המטופלות עדיין מאבדות את ראייתן9. זה הדגיש את הצורך לטפל ברשתית כדי לשמר את הראייה ולשמור על איכות חיים טובה יותר, מה שהוביל להקמת פרוטוקול לטיפול גנטי בעיניים בכבשים.
עין הכבשה מייצגת מודל טוב של העין האנושית בשל הדמיון שלה בממדי הגלובוס של העין, נפח הזגוגית ומבנה הרשתית10,12,13. מאמר זה מפרט את הפרוטוקול הניתוחי להעברת IVT בנפח קטן (≤100 μL) של וקטור ויראלי טיפולי לעין הביצית.
זריקות תוך-ורידיות הן אחד ההליכים הכירורגיים הנפוצים ביותר ברפואת עיניים אנושית והוכחו כיעילות במתן טיפולים גנטיים בתיווך AAV לרשתית הכבשים. הוכחנו בעבר את היעילות של AAV9. טיפול גנטי CLN5 הניתן באופן תוך-ורידי בהחלשת תפקוד לקוי של הרשתית וניוון בכבשים עם CLN5 NCL15. יש לקוות כי התרגום…
The authors have nothing to disclose.
המחברים מבקשים להודות לד”ר סטיב היפ (BVSc, CertVOphthal) על עזרתו בהקמת פרוטוקול זה ובביצוע הזריקות שתוארו על ידי Murray et al.15. המחברים מכירים גם במימון של CureKids ניו זילנד, קרן המחקר הרפואי של קנטרברי, Neurogene Inc, והאגודה לתמיכה ומחקר של מחלות באטן.
1 mL low dead-space safety syringe with permanently attached 0.5 inch needle | Fisher Scientific, Auckland, New Zealand | 05-561-28 | Covidien Monoject Tuberculin Safety syringe or similar |
1.5 mL microcentrifuge tube | Sigma Aldrich | HS4323 | Autoclave tubes to sterilise prior to use |
Anesthesia machine with gas bench and monitor | Hyvet Anesthesia, Christchurch, New Zealand | ||
Antibiotic eye drops | Teva Pharma Ltd, Auckland, New Zealand | Commercial name: Chlorafast (0.5% chloramphenicol) | |
BrightMount plus anti-fade mounting medium | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab103748 | |
DAPI (4′ ,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | 10236276001 | |
Diazepam sedative | Ilium, Troy Laboratories Pty Ltd, Tauranga, New Zealand | 5 mg/mL | |
Endotracheal tubes | Flexicare Medical Ltd, Mountain Ash, United Kingdom | Standard, cuffed. Sizes 7, 7.5, or 8 depending on sheep size | |
Eye speculum | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | KP151/14 | Nopa Barraquer-Colibri (10 mm) |
Fenestrated surgical drape | Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand | DI583 | Or similar |
Filter Tips | Interlab, Auckland, New Zealand | 10, 200, and 1,000 µL | |
Formaldehyde solution (37%) | Fisher Scientific, Auckland, New Zealand | AJA809-2.5PL | Make up to 10% in distilled water with 0.9% NaCl |
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen Carlsbad, CA, USA | A-11012 | Use at a dilution of 1:500 |
Isoflurane anesthetic | Attane, Bayer Animal Health, Auckland, New Zealand | ||
Ketamine HCl anesthetic/analgesic | PhoenixPharm Distributors Ltd, Auckland, New Zealand | 100 mg/mL | |
Laryngoscope (veterinary) | KaWe Medical, Denmark | Miller C blade, size 2 | |
Needles | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | 302025 | BD Hypodermic Needles, or similar |
Non-steroidal anti-inflammatory | Boehringer Ingelheim (NZ) Ltd, Auckland, New Zealand | 49402/008 | Commercial name: Metacam 20 (20 mg/mL meloxicam) |
Non-toothed forceps | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AB864/16 | Or similar |
Non-toothed hemostat | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AA150/12 | Or similar |
Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand | 16210072 | |
Oxygen (medical) | BOC Gas, Christchurch, New Zealand | D2 cylinder, gas code 180 | |
Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand | 10010023 | Sterile, filtered |
Povidone-Iodine solution | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | 005835 | Commercial name: Betadine (10% povidone-iodine) |
Rabbit anti-cow glial fibrillary acidic protein (GFAP) | Dako, Glostrup, Denmark | Z0334 | Use at a dilution of 1:2,500 |
Self-complementary adeno-associated virus serotype 9, containing the chicken beta action (CBh) promoter and codon-optimized ovine CLN5 | University of North Carolina Vector Core, NC, USA. | scAAV9/CBh-oCLN5opt | |
Sodium Chloride 0.9% IV Solution | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AHB1322 | Commercial name: Saline solution |
Subcutaneous antibiotics | Intervet Schering Plough Animal Health Ltd, Wellington, New Zealand | Commercial name: Duplocillin LA (150,000 IU/mL procaine penicillin and 115,000 IU/mL benzathine penicillin) | |
Surgical sharp blunt curved scissors | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | SSSHBLC130 | |
Terumo Syringe Luer Lock | Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand | SH159/SH160 | Sterile syringes; 10 mL for drawing up induction drugs, 20 mL for drawing up saline |
Virkon Disinfectant Powder | EBOS Group Ltd, Christchurch, NZ | 28461115 |