Reativação de Modelos celulares desmembrados em Chlamydomonas reinhardtii
Summary
A reativação in vitro de células motil é um experimento crucial na compreensão dos mecanismos da motilidade celular. O protocolo descreve a reativação dos modelos de células demembradas de Chlamydomonas reinhardtii, um organismo modelo para estudar cílio/flagela.
Abstract
Desde o experimento histórico sobre a contração de músculo glicerinado adicionando ATP, que Szent-Györgyi demonstrou em meados do século XX, a reativação in vitro de células demembradas tem sido uma maneira tradicional e potente de examinar a motilidade celular. A vantagem fundamental deste método experimental é que a composição da solução de reativação pode ser facilmente alterada. Por exemplo, um ambiente de concentração de alta Ca2+ que ocorre apenas temporariamente devido à excitação da membrana in vivo pode ser replicado em laboratório. A cilia eucariótica (também conhecida como flagella) são máquinas de motilidade elaboradas cujos mecanismos regulatórios ainda devem ser esclarecidos. A alga verde unicelular Chlamydomonas reinhardtii é um excelente organismo modelo no campo de pesquisa da cília. Os experimentos de reativação utilizando modelos celulares demembrados de C. reinhardtii e seus derivados, como axonemes desmembraados de cílios isolados, contribuíram significativamente para a compreensão dos mecanismos moleculares da motilidade ciliar. Esses experimentos esclareceram que a ATP energiza a motilidade ciliar e que vários sinais celulares, incluindo ca2+, cAMP e espécies reativas de oxigênio, modulam movimentos ciliares. O método preciso para desmembranação de células C. reinhardtii e reativação dos modelos celulares é descrito aqui.
Introduction
A reativação in vitro de células motil desmembradas é uma ferramenta valiosa para estudar a base molecular para o mecanismo regulatório da motilidade celular. Szent-Györgyi demonstrou pela primeira vez contração in vitro de fibras musculares esqueléticas de coelho extraídas com 50% de glicerol adicionando adenosina triphosfato (ATP)1. Este experimento foi o primeiro a provar que a ATP energiza a contração muscular. A metodologia logo foi aplicada ao estudo da motilidade ciliar/flagellar energizada da ATP, como a flagela2, o Paramecium cilia3 e o Chlamydomonas reinhardtii cilia (também chamado de flagela)4 usando detergentes não iônicos para demembranation.
A alga verde unicelular C. reinhardtii é um organismo modelo para estudar cílios: nada com duas cílios batendo-as como um nado de peito5 humano. O movimento ciliar é impulsionado por dynein, uma proteína motor baseada em microtúbulo sem fim 6,7. Dyneins ciliares podem ser classificados em dyneins de braço externo e dyneins de braço interno. Mutantes sem cada tipo de dynein foram isolados como mutantes de natação lenta com diferentes anormalidades de motilidade. Análise detalhada de motilidade in vitro desses mutantes tem avançado significativamente a pesquisa de dynein8.
Muitos achados importantes foram alcançados utilizando este método e seus derivados desde que o experimento de reativação in vitro de células C. reinhardtii (modelos celulares) foi estabelecido. A reativação de modelos celulares em uma série de buffers Ca2+, por exemplo, mostrou9 que dois cílios são regulados de forma diferente pelo submicromolar Ca2+, e este controle assimétrico de clia permite a orientação fototática de C. reinhardtii10. Além disso, ambos os cilia mostram a conversão de forma de onda do modo de natação para a frente (chamado de forma de onda assimétrica) para o modo de natação para trás (chamado de forma de onda simétrica que aparece por um curto período quando as células estão foto ou mecano-chocadas)11,12. Essa conversão de forma de onda é regulada pelo submillimolar Ca2+, que foi demonstrado pela reativação do chamado aparelho nucleoflagelar (complexo contendo dois cílios, os corpos basais, as estruturas que ligam os corpos basais ao núcleo, e o remanescente do núcleo)11 ou axonemes de cílias isoladas13. Além do Ca2+, a postura de redox (redução-oxidação) é um sinal que regula a frequência de batida ciliar, que foi demonstrada pela reativação de modelos celulares em buffers de redox contendo diferentes razões de glutathione reduzida versus glutationaoxidada 14. Além disso, o monofosfato de adenosina cíclica (cAMP) regula assimétricamente dois cílios, o que foi mostrado pela reativação de axonemes com cAMP15 enjaular fotocleásable. Esses achados in vitro, combinados com achados genéticos, levaram a uma compreensão mais profunda dos mecanismos moleculares da regulação da clia em C. reinhardtii.
Um protocolo para reativar os modelos de células é descrito aqui. O método é simples, permite várias modificações, e pode ser aplicado a múltiplos organismos que se movem com cílios. No entanto, como as células demembraadas são frágeis, é preciso algumas dicas para reativar a motilidade dos modelos celulares com boa eficiência, evitando a dissociação.
Protocol
Representative Results
Discussion
Há dois passos críticos neste protocolo. O primeiro é um processo conhecido como demembranation, que precisa ser realizado suavemente, mas minuciosamente. A deciliação (ou seja, o descolamento de cílios do corpo celular) é induzida por tubulação vigorosa ou vórtice, tornando os modelos celulares imóveis mesmo após a adição de ATP. Normalmente, 5 × 107 células estão suspensas em ~0,5 mL de tampão de demembranação (densidade celular final: 1 × 108 células/mL). A taxa de reativaç…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado por subsídios da Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência KAKENHI (https://www.jsps.go.jp/english/index.html) para a ONU (19K23758, 21K06295) e K.W. (19H03242, 20K21420, 21H00420), da Ohsumi Frontier Science Foundation (https://www.ofsf.or.jp/en/) à K.W., e da Aliança Dinâmica para Inovação Aberta conectando Humanos, Ambientais e Materiais (http://alliance.tagen.tohoku.ac.jp/english/) para a N.U. e K.W. Agradecemos à Sra. Miyuki Shinohara (Hosei Univ.) por sua ajuda na preparação dos números.
Materials
| 0.5 mL plastic tube | QSP | 502-PLN-Q | |
| 15 mL conical tube | SARSTEDT | 62.554.502 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sima-Aldrich | A2383 | |
| Centrifuge | KUBOTA | 2800 | |
| Chlamydomonas strain CC-125 | Chlamydomonas Resource Center | https://www.chlamycollection.org/ | |
| Creatine kinase | Merck | CK-RO | |
| Creatine phosphate | Merck | CRPHO-RO | |
| Dithiothreitol (DTT) | Nakalai tesque | 14128-46 | |
| GEDTA(EGTA) | Dojindo | G002 | |
| Hepes | Dojindo | GB70 | |
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896 | IUPAC name is octylphenoxypolyethoxyethanol: IGEPAL CA-630 is a substitute for Nonidet P-40 (NP-40); NP-40 is no longer available in Sigma-Aldrich. |
| MgSO4-7H2O | Nakalai tesque | 21002-85 | |
| Microscope | Olympus | BX-53 | |
| Pasteur pipette | fisher scientific | 13-678-20C | |
| Polyethylene glycol, Mr 20,000 | Merck | 8.18897.1000 | |
| Pottasium acetate | Nakalai tesque | 28434-25 | |
| Sodium Hydroxide | Nacalai | 31511-05 | |
| Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 196-00015 |
Referências
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