Реактивация моделей демембранированных клеток в Chlamydomonas reinhardtii
Summary
Реактивация подвижных клеток in vitro является решающим экспериментом в понимании механизмов подвижности клеток. Протокол описывает реактивацию демембранированных клеточных моделей Chlamydomonas reinhardtii, модельного организма для изучения ресничек / жгутиков.
Abstract
Со времени исторического эксперимента по сокращению глицеринированных мышц путем добавления АТФ, который Сент-Дьёрдьи продемонстрировал в середине 20-го века, реактивация демембранированных клеток in vitro была традиционным и мощным способом изучения подвижности клеток. Фундаментальным преимуществом этого экспериментального метода является то, что состав реактивационного раствора может быть легко изменен. Например, среда с высокой концентрацией Ca2+ , которая возникает только временно из-за возбуждения мембраны in vivo , может быть воспроизведена в лаборатории. Эукариотические реснички (также известные как жгутики) являются сложным механизмом подвижности, регуляторные механизмы которого еще предстоит выяснить. Одноклеточная зеленая водоросль Chlamydomonas reinhardtii является отличным модельным организмом в области исследований ресничек. Эксперименты по реактивации с использованием демембранированных клеточных моделей C. reinhardtii и их производных, таких как демембранированные аксонемы изолированных ресничек, в значительной степени способствовали пониманию молекулярных механизмов цилиарной моторики. Эти эксперименты показали, что АТФ заряжает энергией цилиарную подвижность и что различные клеточные сигналы, включая Ca2+, цАМФ и активные формы кислорода, модулируют цилиарные движения. Здесь описан точный метод демембранации клеток C. reinhardtii и реактивации клеточных моделей.
Introduction
Реактивация in vitro демембранированных подвижных клеток является ценным инструментом для изучения молекулярной основы регуляторного механизма подвижности клеток. Сент-Дьёрдьи впервые продемонстрировал in vitro сокращение волокон скелетных мышц кролика, извлеченных с 50% глицерином путем добавления аденозинтрифосфата (АТФ)1. Этот эксперимент был первым, доказавшим, что АТФ активизирует сокращение мышц. Методология вскоре была применена для изучения атф-энергетической цилиарной /жгутиковой подвижности, такой как жгутики сперматозоидов2, Paramecium cilia 3 и Chlamydomonas reinhardtii cilia (также называемые жгутиками)4 с использованием неионных детергентов для демембранации.
Одноклеточная зеленая водоросль C. reinhardtii является модельным организмом для изучения ресничек: она плавает с двумя ресничками, обыгрывая их, как брассомчеловека 5. Цилиарное движение управляется динеином, моторным белком на основе микротрубочек 6,7. Цилиарные динеины можно классифицировать на наружные динеины и внутренние динеины. Мутанты, лишенные каждого вида динеина, были выделены как медленно плавающие мутанты с различными аномалиями моторики. Подробный анализ подвижности этих мутантов in vitro значительно продвинул исследование динеина8.
Многие важные результаты были достигнуты с использованием этого метода и его производных с тех пор, как был создан эксперимент по реактивации in vitro демембранированных клеток C. reinhardtii (клеточные модели). Реактивация клеточных моделей в серии буферов Ca2+, например, показала9, что две реснички по-разному регулируются субмикромолярным Ca2+, и этот асимметричный контроль ресничек обеспечивает фототаксическую ориентацию C. reinhardtii10. Кроме того, обе реснички показывают преобразование формы сигнала из режима прямого плавания (называемого асимметричной формой сигнала) в режим обратного плавания (называемый симметричной формой волны, которая появляется в течение короткого периода, когда клетки фото- или механо-шокированы)11,12. Это преобразование формы сигнала регулируется субмиллимолярным Ca2+, что было показано реактивацией так называемого нуклеофлагеллярного аппарата (комплекса, содержащего две реснички, базальные тела, структуры, связывающие базальные тела с ядром, и остаток ядра)11 или демембранированные аксонемы изолированных ресничек13. Помимо Ca2+, окислительно-восстановительное (восстановительно-окислительное) равновесие является сигналом, регулирующим частоту цилиарного биения, что было показано реактивацией клеточных моделей в окислительно-восстановительных буферах, содержащих различные соотношения восстановленного глутатиона и окисленного глутатиона14. Кроме того, циклический аденозинмонофосфат (цАМФ) асимметрично регулирует две реснички, что было показано реактивацией аксонем с фоторасщепляемыми клетками цАМФ15. Эти результаты in vitro в сочетании с генетическими находками привели к более глубокому пониманию молекулярных механизмов регуляции ресничек у C. reinhardtii.
Протокол для реактивации моделей клеток описан здесь. Метод прост, допускает различные модификации и может быть применен к нескольким организмам, которые движутся с ресничками. Однако, поскольку демембранированные клетки являются хрупкими, требуются некоторые советы для реактивации подвижности клеточных моделей с хорошей эффективностью, предотвращая дециляцию.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом протоколе есть два важных шага. Первый — это процесс, известный как демембранация, который необходимо проводить мягко, но тщательно. Дециляция (т.е. отделение ресничек от тела клетки) индуцируется энергичным пипетированием или вихрем, что делает клеточные модели неподвижными даж…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано грантами Японского общества содействия развитию науки KAKENHI (https://www.jsps.go.jp/english/index.html) в Нью-Йорк (19K23758, 21K06295) и K.W. (19H03242, 20K21420, 21H00420), от Ohsumi Frontier Science Foundation (https://www.ofsf.or.jp/en/) до K.W. и от Динамического альянса за открытые инновации, соединяющие человека, окружающую среду и материалы (http://alliance.tagen.tohoku.ac.jp/english/) в N.U. и K.W. Мы благодарим г-жу Миюки Синохара (Университет Хосей) за ее помощь в подготовке цифр.
Materials
| 0.5 mL plastic tube | QSP | 502-PLN-Q | |
| 15 mL conical tube | SARSTEDT | 62.554.502 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sima-Aldrich | A2383 | |
| Centrifuge | KUBOTA | 2800 | |
| Chlamydomonas strain CC-125 | Chlamydomonas Resource Center | https://www.chlamycollection.org/ | |
| Creatine kinase | Merck | CK-RO | |
| Creatine phosphate | Merck | CRPHO-RO | |
| Dithiothreitol (DTT) | Nakalai tesque | 14128-46 | |
| GEDTA(EGTA) | Dojindo | G002 | |
| Hepes | Dojindo | GB70 | |
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896 | IUPAC name is octylphenoxypolyethoxyethanol: IGEPAL CA-630 is a substitute for Nonidet P-40 (NP-40); NP-40 is no longer available in Sigma-Aldrich. |
| MgSO4-7H2O | Nakalai tesque | 21002-85 | |
| Microscope | Olympus | BX-53 | |
| Pasteur pipette | fisher scientific | 13-678-20C | |
| Polyethylene glycol, Mr 20,000 | Merck | 8.18897.1000 | |
| Pottasium acetate | Nakalai tesque | 28434-25 | |
| Sodium Hydroxide | Nacalai | 31511-05 | |
| Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 196-00015 |
Referências
- Szent-Gyorgyi, A. Free-energy relations and contraction of actomyosin. Biological Bulletin. 96 (2), 140-161 (1949).
- Hoffman-Berling, H. Adenosintriphosphat als betriebsstoff von zellbewegungen. Biochimica et Biophysica Acta. 14, 182-194 (1954).
- Naitoh, Y., Kaneko, H. Reactivated Triton-extracted models of Paramecium: modification of ciliary movement by calcium ions. Science. 176 (4034), 523-524 (1972).
- Witman, G. B., Plummer, J., Sander, G. Chlamydomonas flagellar mutants lacking radial spokes and central tubules. Structure, composition, and function of specific axonemal components. Journal of Cell Biology. 76 (3), 729-747 (1978).
- Rüffer, U., Nultsch, W. Flagellar coordination in Chlamydomonas cells held on micropipettes. Cell Motility and the Cytoskeleton. 41 (4), 297-307 (1998).
- Sale, W. S., Satir, P. Direction of active sliding of microtubules in Tetrahymena cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (5), 2045-2049 (1977).
- Fox, L. A., Sale, W. S. Direction of force generated by the inner row of dynein arms on flagellar microtubules. Journal of Cell Biology. 105 (4), 1781-1787 (1987).
- Kamiya, R., Yagi, T. Functional diversity of axonemal dyneins as assessed by in vitro and in vivo motility assays of Chlamydomonas mutants. Zoolog Science. 31 (10), 633-644 (2014).
- Kamiya, R., Witman, G.B. Submicromolar levels of calcium control the balance of beating between the two flagella in demembranated models of Chlamydomonas. Journal of Cell Biology. 98 (1), 97-107 (1984).
- Okita, N., Isogai, N., Hirono, M., Kamiya, R., Yoshimura, K. Phototactic activity in Chlamydomonas 'non-phototactic' mutants deficient in Ca2+-dependent control of flagellar dominance or in inner-arm dynein. Journal of Cell Science. 118 (Pt 3), 529-537 (2005).
- Hyams, J. S., Borisy, G. G. Isolated flagellar apparatus of Chlamydomonas: characterization of forward swimming and alteration of waveform and reversal of motion by calcium ions in vitro. Journal of Cell Science. 33, 235-253 (1978).
- Fujiu, K., Nakayama, Y., Yanagisawa, A., Sokabe, M., Yoshimura, K. Chlamydomonas CAV2 encodes a voltage- dependent calcium channel required for the flagellar waveform conversion. Current Biology. 19 (2), 133-139 (2009).
- Bessen, M., Fay, R. B., Witman, G. B. Calcium control of waveform in isolated flagellar axonemes of Chlamydomonas. Journal of Cell Biology. 86 (2), 446-455 (1980).
- Wakabayashi, K., King, S. M. Modulation of Chlamydomonas reinhardtii flagellar motility by redox poise. Journal of Cell Biology. 173 (5), 743-754 (2006).
- Saegusa, Y., Yoshimura, K. cAMP controls the balance of the propulsive forces generated by the two flagella of Chlamydomonas. Cytoskeleton. 72 (8), 412-421 (2015).
- Gorman, D. S., Levine, R. P. Cytochrome f and plastocyanin: their sequence in the photosynthetic electron transport chain of Chlamydomonas reinhardi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 54 (6), 1665-1669 (1965).
- Takano, W., Hisabori, T., Wakabayashi, K. Rapid estimation of cytosolic ATP concentration from the ciliary beating frequency in the green alga Chlamydomonas reinhardtii. Journal of Biological Chemistry. 296, 100156 (2021).
- CALCON. http://www.bio.chuo-u.ac.jp/nano/calcon.html (2022).
- Wakabayashi, K., Yagi, T., Kamiya, R. Ca2+-dependent waveform conversion in the flagellar axoneme of Chlamydomonas mutants lacking the central-pair/radial spoke system. Cell Motility and the Cytoskeleton. 38 (1), 22-28 (1997).
- Yueh, Y. G., Crain, R. C. Deflagellation of Chlamydomonas reinhardtii follows a rapid transitory accumulation of inositol 1,4,5-trisphosphate and requires Ca2+ entry. Journal of Cell Biology. 123 (4), 869-875 (1993).
- Wakabayashi, K., Ide, T., Kamiya, R. Calcium-dependent flagellar motility activation in Chlamydomonas reinhardtii in response to mechanical agitation. Cell Motility and the Cytoskeleton. 66 (9), 736-742 (2009).
- Ueki, N., Wakabayashi, K. Detergent-extracted Volvox model exhibits an anterior-posterior gradient in flagellar Ca2+ sensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (5), E1061-E1068 (2018).
- Tanno, A. et al. The four-celled Volvocales green alga Tetrabaena socialis exhibits weak photobehavior and high-photoprotection ability. PLoS One. 16 (10), e0259138 (2021).
