क्लैमाइडोमोनास रेनहार्ड्टिई में डिमेम्ब्रेनेटेड सेल मॉडल का पुनर्सक्रियन
Summary
गतिशील कोशिकाओं के इन विट्रो पुनर्सक्रियन में सेल गतिशीलता के तंत्र को समझने में एक महत्वपूर्ण प्रयोग है। प्रोटोकॉल क्लैमाइडोमोनास रेनहार्ड्टी के डिमेम्ब्रेनेटेड सेल मॉडल को फिर से सक्रिय करने का वर्णन करता है, जो सिलिया / फ्लैगेला का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल जीव है।
Abstract
एटीपी जोड़कर ग्लिसरिनेटेड मांसपेशियों के संकुचन पर ऐतिहासिक प्रयोग के बाद से, जो 20 वीं शताब्दी के मध्य में स्ज़ेंट-ग्योर्गी ने प्रदर्शित किया था, डिमेम्ब्रेनेटेड कोशिकाओं के इन विट्रो पुनर्सक्रियन में सेल गतिशीलता की जांच करने का एक पारंपरिक और शक्तिशाली तरीका रहा है। इस प्रयोगात्मक विधि का मौलिक लाभ यह है कि पुनर्सक्रियन समाधान की संरचना को आसानी से बदला जा सकता है। उदाहरण के लिए, एक उच्च-सीए2 + एकाग्रता वातावरण जो केवल विवो में झिल्ली उत्तेजना के कारण अस्थायी रूप से होता है, प्रयोगशाला में दोहराया जा सकता है। यूकेरियोटिक सिलिया (उर्फ फ्लैगेला) विस्तृत गतिशीलता मशीनरी हैं जिनके नियामक तंत्र को अभी भी स्पष्ट किया जाना है। एककोशिकीय हरे रंग की अल्गा क्लैमीडोमोनास रेनहार्ड्टिई सिलिया के अनुसंधान क्षेत्र में एक उत्कृष्ट मॉडल जीव है। रेनहार्ड्टी और उनके डेरिवेटिव के डिमेम्ब्रेनेटेड सेल मॉडल का उपयोग करके पुनर्सक्रियन प्रयोगों, जैसे कि पृथक सिलिया के डिमेम्ब्रेनेटेड एक्सोनेम्स ने सिलिअरी गतिशीलता के आणविक तंत्र को समझने में महत्वपूर्ण योगदान दिया है। उन प्रयोगों ने स्पष्ट किया कि एटीपी सिलिअरी गतिशीलता को सक्रिय करता है और सीए2 +, सीएएमपी और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों सहित विभिन्न सेलुलर सिग्नल, सिलिअरी आंदोलनों को संशोधित करते हैं। सी रेनहार्ड्टिई कोशिकाओं के विघटन और सेल मॉडल के पुनर्सक्रियन के लिए सटीक विधि यहां वर्णित है।
Introduction
डिमेम्ब्रेनेटेड गतिशील कोशिकाओं के इन विट्रो पुनर्सक्रियन सेल गतिशीलता के नियामक तंत्र के लिए आणविक आधार का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण है। स्ज़ेंट-ग्योर्गी ने पहली बार खरगोश कंकाल की मांसपेशी फाइबर के विट्रो संकुचन में एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) 1 जोड़कर 50% ग्लिसरॉल के साथ निकाला। यह प्रयोग यह साबित करने वाला पहला था कि एटीपी मांसपेशियों के संकुचन को सक्रिय करता है। फ्लैगेलर गतिशीलता के अध्ययन के लिए लागू किया गया था, जैसे कि शुक्राणु फ्लैगेला2, पैरामेशियम सिलिया3, और क्लैमिडोमोनास रेनहार्ड्टिई सिलिया (जिसे फ्लैगेला भी कहा जाता है) 4 डिमेम्ब्रेनेशन के लिए गैर-आयनिक डिटर्जेंट का उपयोग करके।
रेनहार्ड्टी सिलिया का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल जीव है: यह मानव के ब्रेस्टस्ट्रोक5 की तरह उन्हें मारकर दो सिलिया के साथ तैरता है। सिलिअरी गति डाइनिन द्वारा संचालित होती है, एक माइनस-एंड निर्देशित सूक्ष्मनलिका-आधारित मोटर प्रोटीन 6,7। सिलिअरी डाइनिन को बाहरी-बांह डाइनिन और आंतरिक-बांह डाइनिन में वर्गीकृत किया जा सकता है। प्रत्येक प्रकार के डायनेन की कमी वाले म्यूटेंट को अलग-अलग गतिशीलता असामान्यताओं के साथ धीमी तैराकी म्यूटेंट के रूप में अलग किया गया है। इन म्यूटेंट के इन विट्रो गतिशीलता विश्लेषण में विस्तृत ने डायनेन अनुसंधान 8 को काफी उन्नतकिया है।
इस विधि और इसके डेरिवेटिव का उपयोग करके कई महत्वपूर्ण निष्कर्ष प्राप्त किए गए हैं क्योंकि डिमेम्ब्रेनेटेड सी रेनहार्ड्टिई कोशिकाओं (सेल मॉडल) के इन विट्रो पुनर्सक्रियन प्रयोग की स्थापना की गई थी। उदाहरण के लिए, सीए2 + बफर की एक श्रृंखला में सेल मॉडल के पुनर्सक्रियन ने9 दिखाया कि दो सिलिया को सबमाइक्रोमोलर सीए2 + द्वारा अलग-अलग विनियमित किया जाता है, और यह विषम सिलिया नियंत्रण सी। इसके अलावा, दोनों सिलिया आगे तैराकी मोड (असममित तरंग कहा जाता है) से पिछड़े तैराकी मोड (सममित तरंग कहा जाता है कि एक छोटी अवधि के लिए प्रकट होता है जब कोशिकाओं फोटो या मेचानो-चौंक जाते हैं) 11,12 करने के लिए तरंग रूपांतरण दिखाते हैं। इस तरंग रूपांतरण को सबमिलिमोलर सीए2 + द्वारा विनियमित किया जाता है, जिसे तथाकथित न्यूक्लियोफ्लैगेलर उपकरण (दो सिलिया, बेसल निकायों, नाभिक के साथ बेसल निकायों को जोड़ने वाली संरचनाओं, और नाभिक के अवशेष युक्त एक परिसर) के पुनर्सक्रियन द्वारा दिखाया गयाथा। सीए2 + के अलावा, रेडॉक्स (कमी-ऑक्सीकरण) शिष्टता एक संकेत है जो सिलिअरी बीटिंग आवृत्ति को नियंत्रित करता है, जिसे रेडॉक्स बफर में सेल मॉडल के पुनर्सक्रियन द्वारा दिखाया गया था जिसमें कम ग्लूटाथियोन बनाम ऑक्सीकरण ग्लूटाथियोन14 के विभिन्न अनुपात होते हैं। इसके अलावा, चक्रीय एडेनोसाइन मोनोफॉस्फेट (सीएएमपी) असममित रूप से दो सिलिया को नियंत्रित करता है, जिसे फोटोक्लेवेबल पिंजरे वाले सीएएमपी15 के साथ एक्सोनेम के पुनर्सक्रियन द्वारा दिखाया गया था। इन इन विट्रो निष्कर्षों में, आनुवांशिक निष्कर्षों के साथ संयुक्त, सी रेनहार्ड्टी में सिलिया विनियमन के आणविक तंत्र की गहरी समझ का नेतृत्व किया है।
सेल मॉडल को फिर से सक्रिय करने के लिए एक प्रोटोकॉल यहां वर्णित है। विधि सरल है, विभिन्न संशोधनों के लिए अनुमति देता है, और कई जीवों पर लागू किया जा सकता है जो सिलिया के साथ चलते हैं। हालांकि, क्योंकि डिमेम्ब्रेनेटेड कोशिकाएं नाजुक होती हैं, इसलिए इसे डिसिलिएशन को रोकने के दौरान अच्छी दक्षता के साथ सेल मॉडल की गतिशीलता को फिर से सक्रिय करने के लिए कुछ युक्तियों की आवश्यकता होती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल में दो महत्वपूर्ण कदम हैं। पहला एक प्रक्रिया है जिसे डिमेम्ब्रेनेशन के रूप में जाना जाता है, जिसे धीरे-धीरे लेकिन अच्छी तरह से करने की आवश्यकता होती है। डेसिलिएशन (यानी, सेल बॉडी से सिलिया …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन को जापान सोसाइटी फॉर द प्रमोशन ऑफ साइंस काकेन्ही (https://www.jsps.go.jp/english/index.html) से एनयू (19के 23758, 21 के 06295) और केडब्ल्यू (1 9 एच 03242, 20 के 21420, 21 एच 00420), ओहसुमी फ्रंटियर साइंस फाउंडेशन (https://www.ofsf.or.jp/en/) से केडब्ल्यू तक, और डायनामिक एलायंस फॉर ओपन इनोवेशन ब्रिजिंग ह्यूमन, पर्यावरण और सामग्री (http://alliance.tagen.tohoku.ac.jp/english/) से लेकर केडब्ल्यू तक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। हम आंकड़ों को तैयार करने में उनकी मदद के लिए सुश्री मियुकी शिनोहारा (होसेई विश्वविद्यालय) को धन्यवाद देते हैं।
Materials
| 0.5 mL plastic tube | QSP | 502-PLN-Q | |
| 15 mL conical tube | SARSTEDT | 62.554.502 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sima-Aldrich | A2383 | |
| Centrifuge | KUBOTA | 2800 | |
| Chlamydomonas strain CC-125 | Chlamydomonas Resource Center | https://www.chlamycollection.org/ | |
| Creatine kinase | Merck | CK-RO | |
| Creatine phosphate | Merck | CRPHO-RO | |
| Dithiothreitol (DTT) | Nakalai tesque | 14128-46 | |
| GEDTA(EGTA) | Dojindo | G002 | |
| Hepes | Dojindo | GB70 | |
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896 | IUPAC name is octylphenoxypolyethoxyethanol: IGEPAL CA-630 is a substitute for Nonidet P-40 (NP-40); NP-40 is no longer available in Sigma-Aldrich. |
| MgSO4-7H2O | Nakalai tesque | 21002-85 | |
| Microscope | Olympus | BX-53 | |
| Pasteur pipette | fisher scientific | 13-678-20C | |
| Polyethylene glycol, Mr 20,000 | Merck | 8.18897.1000 | |
| Pottasium acetate | Nakalai tesque | 28434-25 | |
| Sodium Hydroxide | Nacalai | 31511-05 | |
| Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 196-00015 |
Referências
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