Medida do vasorelaxamento endotélio-dependente na aorta torácica de camundongos utilizando a miografia tensométrica de câmara de pequeno volume
Summary
O presente protocolo descreve os conceitos e a aplicação técnica da técnica do miógrafo tensométrico utilizando um sistema de miógrafo multicâmara na avaliação experimental ex vivo da função endotelial da aorta em camundongos.
Abstract
A miografia tensométrica de câmara de pequeno volume é uma técnica comumente utilizada para avaliar a contratilidade vascular de vasos sanguíneos pequenos e grandes em animais de laboratório e pequenas artérias isoladas do tecido humano. A técnica permite que os pesquisadores mantenham vasos sanguíneos isolados em um ambiente rigidamente controlado e padronizado (quase fisiológico), com a opção de se ajustar a vários fatores ambientais, enquanto desafiam os vasos isolados com diferentes agentes farmacológicos que podem induzir vasoconstrição ou vasodilatação. A câmara miográfica também fornece uma plataforma para medir a reatividade vascular em resposta a vários hormônios, inibidores e agonistas que podem afetar a função do músculo liso e das camadas endoteliais separadamente ou simultaneamente. A parede dos vasos sanguíneos é uma estrutura complexa que consiste em três camadas diferentes: a íntima (camada endotelial), a média (músculo liso e fibras de elastina) e a adventícia (colágeno e outros tecidos conjuntivos). Para obter uma compreensão clara das propriedades funcionais de cada camada, é fundamental ter acesso a uma plataforma e sistema experimental que permita uma abordagem combinatória para estudar todas as três camadas simultaneamente. Tal abordagem exige acesso a uma condição semifisiológica que imitaria o ambiente in vivo em um ambiente ex vivo. A miografia tensométrica de câmara de pequeno volume forneceu um ambiente ideal para avaliar o impacto de pistas ambientais, variáveis experimentais ou agonistas farmacológicos e antagonistas nas propriedades vasculares. Por muitos anos, os cientistas usaram a técnica do miógrafo tensométrico para medir a função endotelial e a contratilidade do músculo liso em resposta a diferentes agentes. Neste relato, um sistema de miógrafo tensométrico de câmara de pequeno volume é usado para medir a função endotelial na aorta isolada de camundongos. Este relatório se concentra em como a miografia tensométrica de câmara de pequeno volume pode ser usada para avaliar a integridade funcional do endotélio em pequenos segmentos de uma grande artéria, como a aorta torácica.
Introduction
Nas últimas décadas, o sistema de miografia de câmara pequena tem sido usado para medir a reatividade de diferentes camadas de paredes dos vasos sanguíneos em resposta a vários agentes farmacológicos e neurotransmissores em um ambiente ex vivo e em tempo real. A reatividade vascular é um componente importante de um vaso sanguíneo funcional saudável e é fundamental para a regulação do fluxo sanguíneo e da perfusão na vasculatura periférica e cerebral1. Dentro da parede dos vasos sanguíneos, a interação entre as camadas endotelial e muscular lisa é um dos principais determinantes do tônus vascular, que também é constantemente impactado por mudanças estruturais na camada de tecido conjuntivo ao redor da parede dos vasos sanguíneos (adventícia).
A camada endotelial controla o vasomovimento liberando alguns fatores vasodilatadores, incluindo óxido nítrico (NO), prostaciclina (PGI2) e fator hiperpolarizador derivado do endotélio (EDHF), ou produzindo agentes vasoconstritores como endotelina-1 (ET-1) e tromboxano (TXA2)2,3,4. Dentre esses fatores, o NO tem sido extensivamente estudado, e seus importantes papéis regulatórios em outras funções celulares críticas, como inflamação, migração, sobrevivência e proliferação, têm sido altamente citados na literatura científica 2,5.
No campo da biologia vascular, a miografia de câmara forneceu aos fisiologistas vasculares e farmacologistas uma ferramenta valiosa e confiável para medir a função endotelial em um sistema semifisiológico rigidamente controlado1. Atualmente, existem dois sistemas de miógrafos diferentes disponíveis para os cientistas: miografia tensométrica (isométrica) de fio (ou pino) e miografia de pressão. Em um sistema de miografia de fio, o vaso sanguíneo é esticado entre dois fios ou pinos, permitindo a medição isométrica do desenvolvimento de força ou tensão na parede do vaso sanguíneo, enquanto a miografia por pressão é uma plataforma preferível para medições de reatividade vascular em artérias de pequena resistência, onde as alterações na pressão arterial são consideradas o principal estímulo para mudanças no tônus vascular e vasomoção. Há um consenso geral de que, para pequenas artérias de resistência, como artérias mesentéricas e cerebrais, a miografia por pressão cria uma condição mais próxima das condições fisiológicas do corpo humano. O miógrafo de câmara pequena pode ser utilizado para vasos com diâmetros muito pequenos (200-500 μm) a vasos muito maiores, como a aorta.
Enquanto o miógrafo de fio é um poderoso sistema para registrar a tensão dos vasos sanguíneos sob condições isométricas, o miógrafo de pressão é um sistema mais apropriado para medir mudanças no diâmetro do vaso em resposta a mudanças nas condições isobáricas. As mudanças de diâmetro no vaso em resposta a mudanças na pressão ou fluxo são muito maiores em uma pequena artéria muscular (arteríola) em comparação com grandes artérias elásticas, como a aorta. Por esses motivos, o miógrafo de pressão é considerado uma ferramenta melhor para pequenos vasos sanguíneos com vasorreatividade substancial1. Um dos outros pontos fortes práticos da miografia tensométrica de câmara de pequeno volume multicâmara é que se pode discernir a contribuição de diferentes mecanismos para a reatividade vascular estudando múltiplos (até quatro) segmentos da mesma artéria e do mesmo animal para reduzir a variabilidade e produzir dados robustos e conclusivos. Também é relativamente fácil de configurar e manter tecnicamente. Vasos de quase qualquer tamanho podem ser estudados com um miógrafo de fio. É uma solução mais econômica para avaliar a função vascular e é uma boa alternativa à miografia por pressão em experimentos em que o comprimento do vaso dissecado é muito curto para o protocolo de miógrafo de pressão.
Este relato fornece um protocolo detalhado para a avaliação da função endotelial no anel aórtico torácico isolado de camundongos utilizando pinos de montagem na técnica de miografia tensométrica de câmara de pequeno volume utilizando o sistema de miógrafo multicâmara DMT-620 (DMT-USA). Este protocolo utiliza um rato C57BL6 macho de 6 meses de idade com um peso médio entre 25-35 g. Felizmente, este protocolo pode ser aplicado a vários tipos e pesos de animais, considerando a ampla gama de tipos de vasos e diâmetros para os quais este protocolo pode ser usado.
Protocol
Representative Results
Discussion
O campo da biologia vascular depende fortemente de ferramentas que ajudam os pesquisadores a avaliar a integridade funcional e estrutural da parede dos vasos sanguíneos. Também requer atenção especial sobre as interações diretas e indiretas entre as três camadas de vasos sanguíneos: a íntima, a mídia e a adventícia. Dentre essas três camadas, a íntima é formada por uma monocamada de células endoteliais e tem uma função muito importante na regulação da saúde vascular e hemostasia.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo financiamento dos Institutos Nacionais de Saúde (R15HL145646) e da Faculdade de Pós-Graduação da Midwestern University.
Materials
| Acetylcholine | SigmaAldrich | A6625-100G | |
| CaCl2 | SigmaAldrich | C4901-1KG | |
| Carbogen gas | Matheson | H103847 | |
| Dissecting scissors | FST | 91460-11 | |
| DMT 620 Multi chamber myograph system | DMT | DMT 620 | Multi chamber myograph system |
| Dumont forceps | FST | 91150-20 | |
| EDTA | SigmaAldrich | E5134-10G | |
| Glucose | SigmaAldrich | G8270-1KG | |
| HEPES | SigmaAldrich | H7006-1KG | |
| KCl | SigmaAldrich | P9541-1KG | |
| KH2PO4 | SigmaAldrich | P5655-1KG | |
| LabChart | ADI instruments | Data acquisition software | |
| Light source | Volpi | 14363 | |
| L-Name | Fischer Scientific | 50-200-7725 | |
| MgSO4 | SigmaAldrich | M2643-500G | |
| Microscope | Leica | S6D | stereo zoom microscope |
| NaCl | SigmaAldrich | S5886-5KG | |
| NaHCO3 | SigmaAldrich | S5761-500G | |
| Organ bath system | DMT | 720MO | |
| Phenylephrine | SigmaAldrich | P6126-10G | |
| Pump | Welch | 2546B-01 | |
| Software | ADI instruments | LabChart 8.1.20 | |
| Spring Scissors | FST | 15003-08 | |
| Sylgard 184 Kit | Electron Microscopy Services | 24236-10 | silicone elastomer kit |
| Tank Regulator | Fischer Scientific | 10575147 | |
| Water bath system | Fischer Scientific | 15-462-10 |
Referências
- Wenceslau, C. F., et al. Guidelines for the measurement of vascular function and structure in isolated arteries and veins. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 321 (1), 77-111 (2021).
- Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: Testing and clinical relevance. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
- Lerman, A., Zeiher, A. M. Endothelial function: Cardiac events. Circulation. 111 (3), 363-368 (2005).
- Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. International Journal of Biological Sciences. 9 (10), 1057-1069 (2013).
- Galley, H. F., Webster, N. R. Physiology of the endothelium. British Journal of Anaesthesia. 93 (1), 105-113 (2004).
- Orita, H., et al. In vitro evaluation of phosphate, bicarbonate, and Hepes buffered storage solutions on hypothermic injury to immature myocytes. Cardiovascular Drugs and Therapy. 8 (6), 851-859 (1994).
- Liu, Y. H., Bian, J. S. Bicarbonate-dependent effect of hydrogen sulfide on vascular contractility in rat aortic rings. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 299 (4), 866-872 (2010).
- Griffiths, K., Madhani, M. The use of wire myography to investigate vascular tone and function. Methods in Molecular Biology: Atherosclerosis. 2419, 361-367 (2022).
- Pfeiffer, S., Leopold, E., Schmidt, K., Brunner, F., Mayer, B. Inhibition of nitric oxide synthesis by NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME): Requirement for bioactivation to the free acid, NG-nitro-L-arginine. British Journal of Pharmacology. 118 (6), 1433-1440 (1996).
- Bacon, P. A. Endothelial cell dysfunction in systemic vasculitis: New developments and therapeutic prospects. Current Opinion in Rheumatology. 17 (1), 49-55 (2005).
- Gallo, G., Volpe, M., Savoia, C. Endothelial dysfunction in hypertension: Current concepts and clinical implications. Frontiers in Medicine. 8, 798958 (2021).
- Mikolajczyk, K., et al. The important role of endothelium and extracellular vesicles in the cellular mechanism of aortic aneurysm formation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 13157 (2021).
- Vallance, P., Hingorani, A. Endothelial nitric oxide in humans in health and disease. International Journal of Experimental Pathology. 80 (6), 291-303 (1999).
- Tousoulis, D., Kampoli, A. M., Tentolouris, C., Papageorgiou, N., Stefanadis, C. The role of nitric oxide on endothelial function. Current Vascular Pharmacology. 10 (1), 4-18 (2012).
- Gibson, C., et al. Mild aerobic exercise blocks elastin fiber fragmentation and aortic dilatation in a mouse model of Marfan syndrome associated aortic aneurysm. Journal of Applied Physiology. 123 (1), 147-160 (2017).
- Xiao, X., Ping, N. N., Li, S., Cao, L., Cao, Y. X. An optimal initial tension for rat basilar artery in wire myography. Microvascular Research. 97, 156-158 (2015).
- Chung, A. W., Yang, H. H., Yeung, K. A., van Breemen, C. Mechanical and pharmacological approaches to investigate the pathogenesis of Marfan syndrome in the abdominal aorta. Journal of Vascular Research. 45 (4), 314-322 (2008).
- Zhong, C., et al. Age impairs soluble guanylyl cyclase function in mouse mesenteric arteries. International Journal of Molecular Sciences. 22 (21), 11412 (2021).
