Измерение эндотелий-зависимого вазорелаксации в грудной аорте мыши с помощью тензометрической малообъемной камерной миографии
Summary
Настоящий протокол описывает концепции и техническое применение метода тензометрического миографа с использованием многокамерной системы миографа в экспериментальной оценке ex vivo функции эндотелия аорты мыши.
Abstract
Тензометрическая миография малой камеры является широко используемым методом оценки сократимости сосудов мелких и крупных кровеносных сосудов у лабораторных животных и мелких артерий, выделенных из тканей человека. Метод позволяет исследователям поддерживать изолированные кровеносные сосуды в строго контролируемой и стандартизированной (почти физиологической) обстановке с возможностью адаптации к различным факторам окружающей среды, одновременно бросая вызов изолированным сосудам различными фармакологическими агентами, которые могут вызывать сужение сосудов или вазодилатацию. Камера миографа также обеспечивает платформу для измерения сосудистой реактивности в ответ на различные гормоны, ингибиторы и агонисты, которые могут влиять на функцию гладких мышц и эндотелиальных слоев отдельно или одновременно. Стенка кровеносного сосуда представляет собой сложную структуру, состоящую из трех различных слоев: интима (эндотелиальный слой), среда (гладкомышечные и эластиновые волокна) и адвентиция (коллаген и другая соединительная ткань). Чтобы получить четкое представление о функциональных свойствах каждого слоя, крайне важно иметь доступ к экспериментальной платформе и системе, которые позволили бы использовать комбинационный подход к изучению всех трех слоев одновременно. Такой подход требует доступа к полуфизиологическому состоянию, которое имитировало бы среду in vivo в условиях ex vivo . Тензометрическая миография малообъемной камеры обеспечила идеальную среду для оценки влияния сигналов окружающей среды, экспериментальных переменных или фармакологических агонистов и антагонистов на сосудистые свойства. В течение многих лет ученые использовали метод тензометрического миографа для измерения функции эндотелия и сократимости гладких мышц в ответ на различные агенты. В этом отчете тензометрическая система миографа с малой объемной камерой используется для измерения эндотелиальной функции в изолированной аорте мыши. В этом отчете основное внимание уделяется тому, как тензометрическая миография малой камеры может быть использована для оценки функциональной целостности эндотелия в небольших сегментах большой артерии, такой как грудная аорта.
Introduction
В течение последних нескольких десятилетий малокамерная миографическая система использовалась для измерения реактивности различных слоев стенок кровеносных сосудов в ответ на различные фармакологические агенты и нейротрансмиттеры в условиях ex vivo в режиме реального времени. Сосудистая реактивность является основным компонентом здорового функционального кровеносного сосуда и имеет решающее значение для регуляции кровотока и перфузии в периферических и церебральных сосудах1. В стенке кровеносного сосуда взаимодействие между эндотелиальными и гладкими мышечными слоями является основным фактором, определяющим тонус сосудов, на который также постоянно влияют структурные изменения в слое соединительной ткани, окружающем стенку кровеносного сосуда (адвентиция).
Эндотелиальный слой контролирует вазомоцию путем высвобождения нескольких сосудорасширяющих факторов, включая оксид азота (NO), простациклин (PGI2) и гиперполяризующий фактор, полученный из эндотелия (EDHF), или путем производства сосудосуживающих агентов, таких как эндотелин-1 (ET-1) и тромбоксан (TXA2)2,3,4. Среди этих факторов NO был широко изучен, и его важные регуляторные роли в других критических клеточных функциях, таких как воспаление, миграция, выживание и пролиферация, были широко упомянуты в научной литературе 2,5.
В области сосудистой биологии камерная миография предоставила сосудистым физиологам и фармакологам ценный и надежный инструмент для измерения функции эндотелия в жестко контролируемой полуфизиологической системе1. В настоящее время ученым доступны две различные системы миографа: проволочная (или штифтовая) тензометрическая (изометрическая) миография и напорная миография. В проволочной миографической системе кровеносный сосуд растягивается между двумя проводами или штифтами, что позволяет изометрически измерять развитие силы или напряжения в стенке кровеносного сосуда, в то время как миография давления является предпочтительной платформой для измерения реактивности сосудов в артериях с малым сопротивлением, где изменения артериального давления считаются основным стимулом для изменения сосудистого тонуса и вазомоции. Существует общее мнение, что для артерий с малым сопротивлением, таких как брыжеечные и мозговые артерии, миография давления создает состояние, которое ближе к физиологическим условиям в организме человека. Малый камерный миограф может быть использован для сосудов с очень малыми диаметрами (200-500 мкм) для гораздо более крупных сосудов, таких как аорта.
В то время как проволочный миограф является мощной системой для регистрации напряжения кровеносных сосудов в изометрических условиях, миограф давления является более подходящей системой для измерения изменений диаметра сосудов в ответ на изменения изобарических условий. Изменения диаметра сосуда в ответ на изменения давления или потока намного больше в небольшой мышечной артерии (артериоле) по сравнению с крупными эластичными артериями, такими как аорта. По этим причинам миограф давления считается лучшим средством для мелких кровеносных сосудов с существенной вазореактивностью1. Одной из других практических сильных сторон многокамерной тензометрической миографии малой камеры является то, что можно различить вклад различных механизмов в сосудистую реактивность, изучая множественные (до четырех) сегменты одной и той же артерии и одного и того же животного для снижения изменчивости и получения надежных и убедительных данных. Он также относительно прост в настройке и обслуживании технически. Сосуды практически любого размера можно изучать с помощью проволочного миографа. Это более экономичное решение для оценки сосудистой функции и хорошая альтернатива миографии давления в экспериментах, где длина рассеченного сосуда слишком коротка для протокола миографа давления.
В настоящем отчете представлен подробный протокол оценки функции эндотелия в изолированном грудном аортальном кольце мыши с использованием крепежных штифтов в методе тензометрической миографии малообъемной камеры с использованием многокамерной миографической системы DMT-620 (DMT-США). В этом протоколе используется 6-месячный самец мыши C57BL6 со средним весом от 25 до 35 г. К счастью, этот протокол может быть применен к различным типам животных и весам, учитывая широкий диапазон типов и диаметров сосудов, для которых этот протокол может быть использован.
Protocol
Representative Results
Discussion
Область сосудистой биологии в значительной степени опирается на инструменты, которые помогают исследователям оценить функциональную и структурную целостность стенки кровеносных сосудов. Это также требует особого внимания к прямым и косвенным взаимодействиям между тремя слоями кро?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана финансированием Национальных институтов здравоохранения (R15HL145646) и Колледжа аспирантуры Университета Среднего Запада.
Materials
| Acetylcholine | SigmaAldrich | A6625-100G | |
| CaCl2 | SigmaAldrich | C4901-1KG | |
| Carbogen gas | Matheson | H103847 | |
| Dissecting scissors | FST | 91460-11 | |
| DMT 620 Multi chamber myograph system | DMT | DMT 620 | Multi chamber myograph system |
| Dumont forceps | FST | 91150-20 | |
| EDTA | SigmaAldrich | E5134-10G | |
| Glucose | SigmaAldrich | G8270-1KG | |
| HEPES | SigmaAldrich | H7006-1KG | |
| KCl | SigmaAldrich | P9541-1KG | |
| KH2PO4 | SigmaAldrich | P5655-1KG | |
| LabChart | ADI instruments | Data acquisition software | |
| Light source | Volpi | 14363 | |
| L-Name | Fischer Scientific | 50-200-7725 | |
| MgSO4 | SigmaAldrich | M2643-500G | |
| Microscope | Leica | S6D | stereo zoom microscope |
| NaCl | SigmaAldrich | S5886-5KG | |
| NaHCO3 | SigmaAldrich | S5761-500G | |
| Organ bath system | DMT | 720MO | |
| Phenylephrine | SigmaAldrich | P6126-10G | |
| Pump | Welch | 2546B-01 | |
| Software | ADI instruments | LabChart 8.1.20 | |
| Spring Scissors | FST | 15003-08 | |
| Sylgard 184 Kit | Electron Microscopy Services | 24236-10 | silicone elastomer kit |
| Tank Regulator | Fischer Scientific | 10575147 | |
| Water bath system | Fischer Scientific | 15-462-10 |
Referências
- Wenceslau, C. F., et al. Guidelines for the measurement of vascular function and structure in isolated arteries and veins. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 321 (1), 77-111 (2021).
- Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: Testing and clinical relevance. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
- Lerman, A., Zeiher, A. M. Endothelial function: Cardiac events. Circulation. 111 (3), 363-368 (2005).
- Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. International Journal of Biological Sciences. 9 (10), 1057-1069 (2013).
- Galley, H. F., Webster, N. R. Physiology of the endothelium. British Journal of Anaesthesia. 93 (1), 105-113 (2004).
- Orita, H., et al. In vitro evaluation of phosphate, bicarbonate, and Hepes buffered storage solutions on hypothermic injury to immature myocytes. Cardiovascular Drugs and Therapy. 8 (6), 851-859 (1994).
- Liu, Y. H., Bian, J. S. Bicarbonate-dependent effect of hydrogen sulfide on vascular contractility in rat aortic rings. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 299 (4), 866-872 (2010).
- Griffiths, K., Madhani, M. The use of wire myography to investigate vascular tone and function. Methods in Molecular Biology: Atherosclerosis. 2419, 361-367 (2022).
- Pfeiffer, S., Leopold, E., Schmidt, K., Brunner, F., Mayer, B. Inhibition of nitric oxide synthesis by NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME): Requirement for bioactivation to the free acid, NG-nitro-L-arginine. British Journal of Pharmacology. 118 (6), 1433-1440 (1996).
- Bacon, P. A. Endothelial cell dysfunction in systemic vasculitis: New developments and therapeutic prospects. Current Opinion in Rheumatology. 17 (1), 49-55 (2005).
- Gallo, G., Volpe, M., Savoia, C. Endothelial dysfunction in hypertension: Current concepts and clinical implications. Frontiers in Medicine. 8, 798958 (2021).
- Mikolajczyk, K., et al. The important role of endothelium and extracellular vesicles in the cellular mechanism of aortic aneurysm formation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 13157 (2021).
- Vallance, P., Hingorani, A. Endothelial nitric oxide in humans in health and disease. International Journal of Experimental Pathology. 80 (6), 291-303 (1999).
- Tousoulis, D., Kampoli, A. M., Tentolouris, C., Papageorgiou, N., Stefanadis, C. The role of nitric oxide on endothelial function. Current Vascular Pharmacology. 10 (1), 4-18 (2012).
- Gibson, C., et al. Mild aerobic exercise blocks elastin fiber fragmentation and aortic dilatation in a mouse model of Marfan syndrome associated aortic aneurysm. Journal of Applied Physiology. 123 (1), 147-160 (2017).
- Xiao, X., Ping, N. N., Li, S., Cao, L., Cao, Y. X. An optimal initial tension for rat basilar artery in wire myography. Microvascular Research. 97, 156-158 (2015).
- Chung, A. W., Yang, H. H., Yeung, K. A., van Breemen, C. Mechanical and pharmacological approaches to investigate the pathogenesis of Marfan syndrome in the abdominal aorta. Journal of Vascular Research. 45 (4), 314-322 (2008).
- Zhong, C., et al. Age impairs soluble guanylyl cyclase function in mouse mesenteric arteries. International Journal of Molecular Sciences. 22 (21), 11412 (2021).
