Используя недорогой катионный полимер полиэтиленимин (PEI), мы произвели лентивирусные частицы для стабильной экспрессии шРНК в эмбриональных стволовых клетках человека H9 (hESCs) и транзиторно трансдуцированных нейронных клетках-предшественниках H9 (NPC) с высокой эффективностью.
Текущий протокол описывает использование лентивирусных частиц для доставки коротких шпильковых РНК (шРНК) как к эмбриональным стволовым клеткам человека (hESCs), так и к нейронным клеткам-предшественникам (NPC), полученным из hESCs с высокой эффективностью. Лентивирусные частицы генерировали путем котрансфекции клеток HEK293T с использованием входных векторов (несущих шРНК) вместе с упаковочными плазмидами (pAX и pMD2.G) с использованием недорогого катионного полимера полиэтиленимина (PEI). Вирусные частицы концентрировали с помощью ультрацентрифугирования, что приводило к средним титрам выше 5 х 107. Как hESCs, так и NPC могут быть инфицированы с высокой эффективностью с использованием этих лентивирусных частиц, как показано отбором пуромицина и стабильной экспрессией в hESCs, а также транзиторной экспрессией GFP в NPC. Кроме того, анализ вестерн-блот показал значительное снижение экспрессии генов, нацеленных на шРНК. Кроме того, клетки сохраняли свою плюрипотентность, а также дифференцировочный потенциал, о чем свидетельствует их последующая дифференцировка в различные линии ЦНС. Действующий протокол касается доставки шРНК; однако тот же подход может быть использован для эктопической экспрессии кДНК для исследований гиперэкспрессии.
Эмбриональные стволовые клетки человека (hESCs), полученные из внутренней клеточной массы бластоцисты, являются плюрипотентными и могут быть дифференцированы в различные типы клеток в зависимости от внешних факторов в условиях in vitro 1,2. Чтобы в полной мере использовать потенциал hESCs, необходимо иметь быстрые и надежные методы доставки генов для этих клеток. Условно используемые методы можно в широком смысле классифицировать на два типа: невирусные и вирусные системы доставки генов 3,4. Наиболее часто используемыми невирусными системами доставки генов являются липофекция, электропорация и нуклеофекция. Невирусные системы доставки являются выгодными из-за меньшего количества мутаций вставки и общего снижения иммуногенности 5,6. Однако эти методы приводят к низкой эффективности трансфекции и короткой продолжительности экспрессии транзиторных генов, что является основным ограничением для долгосрочных исследований дифференцировки7. Электропорация приводит к лучшей эффективности трансфекции по сравнению с липофекцией; однако это приводит к гибели более 50% клеток 8,9,10. Используя нуклеофекцию, выживаемость клеток и эффективность трансфекции могут быть улучшены путем сочетания липофекции и электропорации, но подход требует клеточных буферов и специализированного оборудования и, таким образом, становится довольно дорогостоящим для масштабируемых приложений11,12.
Напротив, вирусные векторы показали улучшенную эффективность трансфекции, а также общую низкую цитотоксичность после трансдукции. Кроме того, доставленные гены стабильно экспрессируются и, следовательно, делают этот метод идеальным для долгосрочных исследований13. Среди наиболее часто используемых вирусных векторов для доставки генов в hESCs – лентивирусные векторы (LVS), которые могут дать более 80% эффективности трансдукции с использованием высоких титров вирусных частиц14,15. Липофекция и осаждение CaPO4 являются одними из наиболее часто используемых методов временной трансфекции клеток HEK293T или их производных с помощью векторов переноса генов вместе с упаковкой плазмид для получения лентивирусных частиц16. Хотя липофекция приводит к хорошей эффективности трансфекции и низкой цитотоксичности, методу препятствует его стоимость, и масштабирование для получения высоких титров лентивирусных частиц было бы очень дорогостоящим. Осаждение CaPO4 приводит к относительно сходной эффективности трансфекции с теми, которые получены с помощью липофекции. Несмотря на рентабельность, осаждение CaPO4 приводит к значительной гибели клеток после трансфекции, что затрудняет стандартизацию и позволяет избежать вариаций от партии к партии17. В этом сценарии разработка метода, который дает высокую эффективность трансфекции, низкую цитотоксичность и экономическую эффективность, имеет решающее значение для производства высокотитерных лентивирусных частиц, которые будут использоваться в гЭСК.
Полиэтиленимин (PEI) представляет собой катионный полимер, который может трансфектировать клетки HEK293T с высокой эффективностью без особой цитотоксичности и имеет незначительную стоимость по сравнению с методами18 на основе липофекции. В этой ситуации PEI может быть использован для расширенного применения производства LVS с высоким титром за счет концентрации лентивирусных частиц из супернатантов культуры с использованием различных методов. В представленной статье описано применение PEI для трансфекции клеток HEK293T и концентрации лентивирусных векторов с использованием ультрацентрифугирования через сахарозную подушку. Используя этот метод, мы регулярно получаем титры значительно выше 5 x 107 МЕ/мл с низкими вариациями от партии к партии. Метод прост, прост и экономически эффективен для масштабируемых приложений для доставки генов в гЭСК и клетки, полученные из гЭСК.
Способность генетически модифицировать стволовые клетки для изучения или клинических целей ограничена как технологией, так и базовым пониманием биологии hESCs. Методы, которые показали значительный потенциал в мышиных ЭСК, такие как липофекция и электропорация, не очень эффективны для …
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана исследовательскими грантами Университета Объединенных Арабских Эмиратов (ОАЭУ), грантом No 31R170 (Центр медицинских наук Зайеда) и No 12R010 (грант ОАЭУ-АУА). Мы благодарим профессора Рэндалла Морса (Центр Уодсворта, Олбани, Нью-Йорк) за помощь в редактировании рукописи для стиля и грамматики.
Все данные предоставляются по запросу.
2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 31350010 | |
38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes | Beckman Coulter | C14292 | |
Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | |
bFGF Recombinant human | Invitrogen | PHG0261 | |
Bovine serum albumin FRAC V | Invitrogen | 15260037 | |
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 354234 | |
Cyclopamine | Stem Cell Technologies | 72074 | |
DMEM media | Invitrogen | 11995073 | |
DMEM Nutrient mix F12 | Invitrogen | 11320033 | |
DPBS w/o: Ca and Mg | PAN Biotech | P04-36500 | |
Fetal bovie serum | Invitrogen | 10270106 | |
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody | CST | 2118S | |
Gentle Cell Dissociation Reagent | Stem Cell Technologies | 7174 | |
HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100X Solution | GE healthcare | SH30238.01 | |
L Glutamine, 100X | Invitrogen | 2924190090 | |
L2HGDH Polyclonal antibody | Proteintech | 15707-1-AP | |
L2HGDH shRNA | Macrogen | Seq: CGCATTCTTCATGTGAGAAAT | |
Lipofectamine 3000 kit | Thermo Fisher | L3000001 | |
mTesR1 complete media | Stem Cell Technologies | 85850 | |
Neurobasal medium 1X CTS | Invitrogen | A1371201 | |
Neuropan 2 Supplement 100x | PAN Biotech | P07-11050 | |
Neuropan 27 Supplement 50x | PAN Biotech | P07-07200 | |
Penicillin streptomycin SOL | Invitrogen | 15140122 | |
pLKO.1 TRC vector | Addgene | 10878 | |
pLL3.7 vector | Addgene | 11795 | |
pMD2.G | Addgene | 12259 | |
Polybrene infection reagent | Sigma | TR1003- G | |
Polyethylenimine, branched | Sigma | 408727 | |
psPAX2.0 | Addgene | 12260 | |
Purmorphamine | Tocris | 4551/10 | |
Puromycin | Invitrogen | A1113802 | |
ROCK inhibitor Y-27632 dihydrochloride |
Tocris | 1254 | |
SB 431542 | Tocris | 1614/10 | |
Trypsin .05% EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
XAV 939 | Tocris | 3748/10 |