Лентивирусная опосредованная доставка шРНК в гЭСК и NPC с использованием недорогого катионного полимера полиэтиленимина (PEI)

Summary

Используя недорогой катионный полимер полиэтиленимин (PEI), мы произвели лентивирусные частицы для стабильной экспрессии шРНК в эмбриональных стволовых клетках человека H9 (hESCs) и транзиторно трансдуцированных нейронных клетках-предшественниках H9 (NPC) с высокой эффективностью.

Abstract

Текущий протокол описывает использование лентивирусных частиц для доставки коротких шпильковых РНК (шРНК) как к эмбриональным стволовым клеткам человека (hESCs), так и к нейронным клеткам-предшественникам (NPC), полученным из hESCs с высокой эффективностью. Лентивирусные частицы генерировали путем котрансфекции клеток HEK293T с использованием входных векторов (несущих шРНК) вместе с упаковочными плазмидами (pAX и pMD2.G) с использованием недорогого катионного полимера полиэтиленимина (PEI). Вирусные частицы концентрировали с помощью ультрацентрифугирования, что приводило к средним титрам выше 5 х 10⁷. Как hESCs, так и NPC могут быть инфицированы с высокой эффективностью с использованием этих лентивирусных частиц, как показано отбором пуромицина и стабильной экспрессией в hESCs, а также транзиторной экспрессией GFP в NPC. Кроме того, анализ вестерн-блот показал значительное снижение экспрессии генов, нацеленных на шРНК. Кроме того, клетки сохраняли свою плюрипотентность, а также дифференцировочный потенциал, о чем свидетельствует их последующая дифференцировка в различные линии ЦНС. Действующий протокол касается доставки шРНК; однако тот же подход может быть использован для эктопической экспрессии кДНК для исследований гиперэкспрессии.

Introduction

Эмбриональные стволовые клетки человека (hESCs), полученные из внутренней клеточной массы бластоцисты, являются плюрипотентными и могут быть дифференцированы в различные типы клеток в зависимости от внешних факторов в условиях in vitro ^1,2. Чтобы в полной мере использовать потенциал hESCs, необходимо иметь быстрые и надежные методы доставки генов для этих клеток. Условно используемые методы можно в широком смысле классифицировать на два типа: невирусные и вирусные системы доставки генов ^3,4. Наиболее часто используемыми невирусными системами доставки генов являются липофекция, электропорация и нуклеофекция. Невирусные системы доставки являются выгодными из-за меньшего количества мутаций вставки и общего снижения иммуногенности ^5,6. Однако эти методы приводят к низкой эффективности трансфекции и короткой продолжительности экспрессии транзиторных генов, что является основным ограничением для долгосрочных исследований дифференцировки⁷. Электропорация приводит к лучшей эффективности трансфекции по сравнению с липофекцией; однако это приводит к гибели более 50% клеток ^8,9,10. Используя нуклеофекцию, выживаемость клеток и эффективность трансфекции могут быть улучшены путем сочетания липофекции и электропорации, но подход требует клеточных буферов и специализированного оборудования и, таким образом, становится довольно дорогостоящим для масштабируемых приложений^11,12.

Напротив, вирусные векторы показали улучшенную эффективность трансфекции, а также общую низкую цитотоксичность после трансдукции. Кроме того, доставленные гены стабильно экспрессируются и, следовательно, делают этот метод идеальным для долгосрочных исследований¹³. Среди наиболее часто используемых вирусных векторов для доставки генов в hESCs – лентивирусные векторы (LVS), которые могут дать более 80% эффективности трансдукции с использованием высоких титров вирусных частиц^14,15. Липофекция и осаждение CaPO₄ являются одними из наиболее часто используемых методов временной трансфекции клеток HEK293T или их производных с помощью векторов переноса генов вместе с упаковкой плазмид для получения лентивирусных частиц¹⁶. Хотя липофекция приводит к хорошей эффективности трансфекции и низкой цитотоксичности, методу препятствует его стоимость, и масштабирование для получения высоких титров лентивирусных частиц было бы очень дорогостоящим. Осаждение CaPO₄ приводит к относительно сходной эффективности трансфекции с теми, которые получены с помощью липофекции. Несмотря на рентабельность, осаждение CaPO₄ приводит к значительной гибели клеток после трансфекции, что затрудняет стандартизацию и позволяет избежать вариаций от партии к партии¹⁷. В этом сценарии разработка метода, который дает высокую эффективность трансфекции, низкую цитотоксичность и экономическую эффективность, имеет решающее значение для производства высокотитерных лентивирусных частиц, которые будут использоваться в гЭСК.

Полиэтиленимин (PEI) представляет собой катионный полимер, который может трансфектировать клетки HEK293T с высокой эффективностью без особой цитотоксичности и имеет незначительную стоимость по сравнению с методами¹⁸ на основе липофекции. В этой ситуации PEI может быть использован для расширенного применения производства LVS с высоким титром за счет концентрации лентивирусных частиц из супернатантов культуры с использованием различных методов. В представленной статье описано применение PEI для трансфекции клеток HEK293T и концентрации лентивирусных векторов с использованием ультрацентрифугирования через сахарозную подушку. Используя этот метод, мы регулярно получаем титры значительно выше 5 x 10⁷ МЕ/мл с низкими вариациями от партии к партии. Метод прост, прост и экономически эффективен для масштабируемых приложений для доставки генов в гЭСК и клетки, полученные из гЭСК.

Protocol

1. Трансфекция клеток HEK293T с использованием реагента PEI или Lipofectamine 3000 Культивирование клеток HEK293T в DMEM + 10% FBS + 1x пенициллин/стрептомицин при 37 °C в увлажненном инкубаторе с атмосферой 5% CO2 и 21% O2 до тех пор, пока они не станут 90% сливающимися перед посевом для трансф…

Representative Results

После переноса генов неизбежно требуется высокая жизнеспособность гЭСК. Несмотря на усилия и оптимизацию протоколов по снижению гибели клеток после электропорации гЭСК, более 50% гибели клеток все еще наблюдается после электропорации этих клеток, наряду с низкой эффективностью трансф…

Discussion

Способность генетически модифицировать стволовые клетки для изучения или клинических целей ограничена как технологией, так и базовым пониманием биологии hESCs. Методы, которые показали значительный потенциал в мышиных ЭСК, такие как липофекция и электропорация, не очень эффективны для …

Materials

2-Mercaptoethanol	Invitrogen	31350010
38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes	Beckman Coulter	C14292
Accutase	Stem Cell Technologies	7920
bFGF Recombinant human	Invitrogen	PHG0261
Bovine serum albumin FRAC V	Invitrogen	15260037
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free	Corning	354234
Cyclopamine	Stem Cell Technologies	72074
DMEM media	Invitrogen	11995073
DMEM Nutrient mix F12	Invitrogen	11320033
DPBS w/o: Ca and Mg	PAN Biotech	P04-36500
Fetal bovie serum	Invitrogen	10270106
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody	CST	2118S
Gentle Cell Dissociation Reagent	Stem Cell Technologies	7174
HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100X Solution	GE healthcare	SH30238.01
L Glutamine, 100X	Invitrogen	2924190090
L2HGDH Polyclonal antibody	Proteintech	15707-1-AP
L2HGDH shRNA	Macrogen		Seq: CGCATTCTTCATGTGAGAAAT
Lipofectamine 3000 kit	Thermo Fisher	L3000001
mTesR1 complete media	Stem Cell Technologies	85850
Neurobasal medium 1X CTS	Invitrogen	A1371201
Neuropan 2 Supplement 100x	PAN Biotech	P07-11050
Neuropan 27 Supplement 50x	PAN Biotech	P07-07200
Penicillin streptomycin SOL	Invitrogen	15140122
pLKO.1 TRC vector	Addgene	10878
pLL3.7 vector	Addgene	11795
pMD2.G	Addgene	12259
Polybrene infection reagent	Sigma	TR1003- G
Polyethylenimine, branched	Sigma	408727
psPAX2.0	Addgene	12260
Purmorphamine	Tocris	4551/10
Puromycin	Invitrogen	A1113802
ROCK inhibitor Y-27632 dihydrochloride	Tocris	1254
SB 431542	Tocris	1614/10
Trypsin .05% EDTA	Invitrogen	25300062
XAV 939	Tocris	3748/10