Innkjøp og perfusjon-decellularisering av svin vaskulariserte klaffer i en tilpasset perfusjonsbioreaktor
Summary
Protokollen beskriver kirurgisk anskaffelse og påfølgende decellularisering av vaskulariserte svineklaffer ved perfusjon av natriumdodecylsulfatvaskemiddel gjennom klaffvaskulaturen i en tilpasset perfusjonsbioreaktor.
Abstract
Store volum bløtvevsdefekter fører til funksjonelle underskudd og kan i stor grad påvirke pasientens livskvalitet. Selv om kirurgisk rekonstruksjon kan utføres ved hjelp av autolog fri klaffoverføring eller vaskularisert komposittallotransplantasjon (VCA), har slike metoder også ulemper. Problemer som morbiditet på donorstedet og vevstilgjengelighet begrenser autolog fri klaffoverføring, mens immunsuppresjon er en betydelig begrensning av VCA. Konstruert vev i rekonstruktiv kirurgi ved hjelp av decellularisering / recellulariseringsmetoder representerer en mulig løsning. Decellulariserte vev genereres ved hjelp av metoder som fjerner innfødt cellulært materiale samtidig som den underliggende ekstracellulære matrisen (ECM) mikroarkitekturen opprettholdes. Disse acellulære stillasene kan deretter recellulariseres med mottakerspesifikke celler.
Denne protokollen beskriver anskaffelses- og decellulariseringsmetodene som brukes til å oppnå acellulære stillaser i en grismodell. I tillegg gir den også en beskrivelse av perfusjonsbioreaktorens design og oppsett. Klaffene inkluderer porcine omentum, tensor fascia lata og den radiale underarmen. Decellularisering utføres via ex vivo perfusjon av lavkonsentrasjon natriumdodecylsulfat (SDS) vaskemiddel etterfulgt av DNase enzymbehandling og pereddiksyresterilisering i en tilpasset perfusjonsbioreaktor.
Vellykket vevsdecellularisering er preget av et hvitt ugjennomsiktig utseende av klaffer makroskopisk. Acellulære klaffer viser fravær av kjerner på histologisk farging og en signifikant reduksjon i DNA-innhold. Denne protokollen kan brukes effektivt til å generere decellulære bløtvevsstillas med bevart ECM og vaskulær mikroarkitektur. Slike stillaser kan brukes i senere recellulariseringsstudier og har potensial for klinisk oversettelse i rekonstruktiv kirurgi.
Introduction
Traumatisk skade og fjerning av svulster kan føre til store og komplekse bløtvevsdefekter. Disse feilene kan svekke pasientens livskvalitet, føre til tap av funksjon, og resultere i permanent uførhet. Mens teknikker som autolog vevsklaffoverføring har blitt praktisert, er problemer med klafftilgjengelighet og morbiditet på donorstedet store begrensninger 1,2,3. Vascularized composite allotransplantation (VCA) er et lovende alternativ som overfører komposittvev, for eksempel muskel, hud, vaskulatur, som en enkelt enhet til mottakere. VCA krever imidlertid langvarig immunsuppresjon, noe som fører til legemiddeltoksisitet, opportunistiske infeksjoner og maligniteter 4,5,6.
Vevskonstruerte acellulære stillaser er en potensiell løsning på disse begrensningene7. Acellulære vevsstillas kan oppnås ved hjelp av decellulariseringsmetoder, som fjerner cellulært materiale fra innfødte vev samtidig som den underliggende ekstracellulære matrisen (ECM) mikroarkitekturen bevares. I motsetning til bruken av syntetiske materialer i vevsteknikk, tilbyr bruken av biologisk avledede stillaser et biomimetisk ECM-substrat som tillater biokompatibilitet og potensialet for klinisk oversettelse8. Etter decellularisering kan den påfølgende recellulariseringen av stillaser med mottakerspesifikke celler generere funksjonelle, vaskulariserte vev med liten eller ingen immunogenisitet 9,10,11. Ved å utvikle en effektiv protokoll for å oppnå acellulært vev ved hjelp av perfusjonsdecellulariseringsteknikker, kan et bredt spekter av vevstyper konstrueres. I sin tur tillater å bygge på denne teknikken applikasjonen til mer komplekse vev. Hittil har perfusjonsdecellularisering av vaskularisert bløtvev blitt undersøkt ved hjelp av enkle vaskulariserte vev som en full tykkelse fasciokutan klaff i gnager 12, svin 13 og menneskelige modeller14, samt porcine rectus abdominis skjelettmuskulatur15. I tillegg har komplekse vaskulariserte vev også blitt perfusjonsdecellularisert som vist i svin og humant øre 16,17 modeller og humane full-face graft modeller18.
Her beskriver protokollen decellularisering av vaskulariserte frie klaffer ved bruk av biologisk avledede ECM-stillaser. Vi presenterer decellularisering av tre klinisk relevante klaffer: 1) omentum, 2) tensor fascia lata og 3) radial underarm, som alle er representative for arbeidshestklaffer som brukes rutinemessig i rekonstruktiv kirurgi og ikke tidligere er undersøkt i dyreforsøk i sammenheng med vevsdecellularisering. Disse bioengineerte klaffene tilbyr en allsidig og lett tilgjengelig plattform som har potensial for kliniske anvendelser for bruk innen reparasjon og rekonstruksjon av store bløtvevsdefekter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den foreslåtte protokollen bruker perfusjon av lav konsentrasjon SDS for å decellularisere en rekke svineavledede klaffer. Med denne prosedyren kan acellulær omentum, tensor fascia lata og radial underarmsklaffer vellykket decellulariseres ved hjelp av en protokoll som favoriserer lav konsentrasjon SDS. Foreløpige optimaliseringseksperimenter har fastslått at SDS ved lav konsentrasjon (0,05%) mellom 2 dager og 5 dager er i stand til å fjerne cellulært materiale for omentum, tensor fascia lata og radial underarmskl…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ingen
Materials
| 0.2 µm pore Acrodisk Filter | VWR | CA28143-310 | |
| 0.9 % Sodium Chloride Solution (Normal Saline) | Baxter | JF7123 | |
| 20 L Polypropylene Carboy | Cole-Parmer | RK-62507-20 | |
| 3-0 Sofsilk Nonabsorbable Surgical Tie | Covidien | LS639 | |
| 3-way Stopcock | Cole-Parmer | UZ-30600-04 | |
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution, 100X | Wisent | 450-115-EL | |
| Atropine Sulphate 15 mg/30ml | Rafter 8 Products | 238481 | |
| BD Angiocath 20-Gauge | VWR | BD381134 | |
| BD Angiocath 22-Gauge | VWR | BD381123 | |
| BD Angiocath 24-Gauge | VWR | BD381112 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | DNAse Co-factor |
| DNase I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit) | Invitrogen | P7589 | |
| DPBS, 10X | Wisent | 311-415-CL | without Ca++/Mg++ |
| Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools | 13008-12 | |
| Heparin, 1000 I.U./mL | Leo Pharma A/S | 453811 | |
| Ketamine Hydrochloride 5000 mg/50 ml | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 612316 | |
| Ismatec Pump Tygon 3-Stop Tubing | Cole-Parmer | RK-96450-40 | Internal Diameter: 1.85 mm |
| Ismatec REGLO 4-Channel Pump | Cole-Parmer | 78001-78 | |
| Ismatec Tubing Cassettes | Cole-Parmer | RK-78016-98 | |
| Isoflurane 99.9%, 250 ml | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2231929 | |
| LB Agar Lennox | Bioshop Canada | LBL406.500 | Sterility testing agar plates |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | DNAse Co-factor |
| Masterflex L/S 16 Tubing | Cole-Parmer | RK-96410-16 | |
| Midazolam 50 mg/10 ml | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2242905 | |
| Monopolar Cautery Pencil | Valleylab | E2100 | |
| Normal Buffered Formalin, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| N°11 scalpel blade | Swann Morton | 303 | |
| Papain from papaya latex | Sigma-Aldrich | P3125 | |
| Peracetic Acid | Sigma-Aldrich | 269336 | |
| Plastic Barbed Connector for 1/4" to 1/8" Tube ID | McMaster-Carr | 5117K61 | |
| Plastic Barbed Tube 90° Elbow Connectors | McMaster-Carr | 5117K76 | |
| Plastic Quick-Turn Tube Plugs | McMaster-Carr | 51525K143 | Male Luer |
| Plastic Quick-Turn Tube Sockets | McMaster-Carr | 51525K293 | Female Luer |
| Punch Biopsy Tool | Integra Miltex | 3332 | |
| Potassium Chloride 40 mEq/20 ml | Hospira Healthcare Corporation | 37869 | |
| Povidone-Iodine, 10% | Rougier | 833133 | |
| Serological Pipet, 2mL | Fisher Science | 13-678-27D | |
| Snap Lid Airtight Containers | SnapLock | 142-3941-4 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate Powder | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| Surgical Metal Ligation Clips, Small | Teleflex | 001200 | |
| Stevens Tenotomy Scissors, 115 mm, straight | B. Braun | BC004R | |
| TruWave Pressure Monitoring Set | Edwards Lifesciences | PX260 |
Referências
- Richardson, D., Fisher, S. E., Vaughan, D. E., Brown, J. S. Radial Forearm Flap Donor-Site Complications and Morbidity: A Prospective Study. Plastic and Reconstructive Surgery. 99 (1), 109-115 (1997).
- Edsander-Nord, &. #. 1. 9. 7. ;., Jurell, G., Wickman, M. Donor-site morbidity after pedicled or free TRAM flap surgery: A prospective and objective study. Plastic and Reconstructive Surgery. 102 (5), 1508-1516 (1998).
- Qian, Y., et al. A systematic review and meta-analysis of free-style flaps: Risk analysis of complications. Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 6 (2), 1651 (2018).
- Issa, F. Vascularized composite allograft-specific characteristics of immune responses. Transplant International. 29 (6), 672-681 (2016).
- Kueckelhaus, M., et al. Vascularized composite allotransplantation: Current standards and novel approaches to prevent acute rejection and chronic allograft deterioration. Transplant International. 29 (6), 655-662 (2016).
- Iske, J., et al. Composite tissue allotransplantation: Opportunities and challenges. Cellular and Molecular Immunology. 16 (4), 343-349 (2019).
- Londono, R., Gorantla, V. S., Badylak, S. F. Emerging implications for extracellular matrix-based technologies in vascularized composite allotransplantation. Stem Cells International. 2016, 1541823 (2016).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Hussey, G. S., Dziki, J. L., Badylak, S. F. Extracellular matrix-based materials for regenerative medicine. Nature Reviews Materials. 3, 159-173 (2018).
- Colazo, J. M., et al. Applied bioengineering in tissue reconstruction, replacement, and regeneration. Tissue Engineering. Part B Reviews. 25 (4), 259-290 (2019).
- Rouwkema, J., Rivron, N. C., van Blitterswijk, C. A. Vascularization in tissue engineering. Trends in Biotechnology. 26 (8), 434-441 (2008).
- Zhang, Q., et al. Decellularized skin/adipose tissue flap matrix for engineering vascularized composite soft tissue flaps. Acta Biomaterialia. 35, 166-184 (2016).
- Jank, B. J., et al. Creation of a bioengineered skin flap scaffold with a perfusable vascular pedicle. Tissue Engineering – Part A. 23 (13-14), 696-707 (2017).
- Giatsidis, G., Guyette, J. P., Ott, H. C., Orgill, D. P. Development of a large-volume human-derived adipose acellular allogenic flap by perfusion decellularization. Wound Repair and Regeneration. 26 (2), 245-250 (2018).
- Zhang, J., et al. Perfusion-decellularized skeletal muscle as a three-dimensional scaffold with a vascular network template. Biomaterials. 89, 114-126 (2016).
- Duisit, J., et al. Decellularization of the porcine ear generates a biocompatible, nonimmunogenic extracellular matrix platform for face subunit bioengineering. Annals of Surgery. 267 (6), 1191-1201 (2018).
- Duisit, J., et al. Perfusion-decellularization of human ear grafts enables ECM-based scaffolds for auricular vascularized composite tissue engineering. Acta Biomaterialia. 73, 339-354 (2018).
- Duisit, J., et al. Bioengineering a human face graft: The matrix of identity. Annals of Surgery. 266 (5), 754-764 (2017).
- Haughey, B. H., Panje, W. R. A porcine model for multiple musculocutaneous flaps. The Laryngoscope. 99 (2), 204-212 (1989).
- Khachatryan, A., et al. Radial Forearm Flap. Microsurgery Manual for Medical Students and Residents: A Step-by-Step Approach. , 177-181 (2021).
- Hammouda, B. Temperature effect on the nanostructure of SDS micelles in water. Journal of Research of the National Institute of Standards and Technology. 118, 151-167 (2013).
- Qu, J., Van Hogezand, R. M., Zhao, C., Kuo, B. J., Carlsen, B. T. Decellularization of a fasciocutaneous flap for use as a perfusable scaffold. Annals of Plastic Surgery. 75 (1), 112-116 (2015).
- Keane, T. J., Swinehart, I. T., Badylak, S. F. Methods of tissue decellularization used for preparation of biologic scaffolds and in vivo relevance. Methods. 84, 25-34 (2015).
- Mendibil, U., et al. Tissue-specific decellularization methods: Rationale and strategies to achieve regenerative compounds. International Journal of Molecular Sciences. 21 (15), 5447 (2020).
- Lupon, E., et al. Engineering vascularized composite allografts using natural scaffolds: A systematic review. Tissue Engineering. Part B Reviews. 28 (3), 677-693 (2022).
- Duisit, J., Maistriaux, L., Bertheuil, N., Lellouch, A. G. Engineering vascularized composite tissues by perfusion decellularization/recellularization: Review. Current Transplantation Reports. 8, 44-56 (2021).
- Adil, A., Xu, M., Haykal, S. Recellularization of bioengineered scaffolds for vascular composite allotransplantation. Frontiers in Surgery. 9, 843677 (2022).
- Phelps, E. A., García, A. J. Engineering more than a cell: Vascularization strategies in tissue engineering. Current Opinion in Biotechnology. 21 (5), 704-709 (2010).
- Pozzo, V., et al. A reliable porcine fascio-cutaneous flap model for vascularized composite allografts bioengineering studies. Journal of Visualized Experiments. (181), e63557 (2022).
- Uygun, B. E., et al. Decellularization and recellularization of whole livers. Journal of Visualized Experiments. (48), e2394 (2011).
- Uzarski, J. S., et al. Epithelial cell repopulation and preparation of rodent extracellular matrix scaffolds for renal tissue development. Journal of Visualized Experiments. (102), e53271 (2015).
- Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33 (31), 7756-7764 (2012).
- Choudhury, D., Yee, M., Sheng, Z. L. J., Amirul, A., Naing, M. W. Decellularization systems and devices: State-of-the-art. Acta Biomaterialia. 115, 51-59 (2020).
- Schilling, B. K., et al. Design and fabrication of an automatable, 3D printed perfusion device for tissue infusion and perfusion engineering. Tissue Engineering. Part A. 26 (5-6), 253-264 (2020).
