הפרוטוקול מתאר את הרכש הכירורגי ולאחר מכן דה-סלוליזציה של דשי חזיר וסקולריים על ידי זלוף של דטרגנט נתרן דודציל סולפט דרך כלי הדם של הדש בביוריאקטור פרפוזיה מותאם אישית.
פגמים ברקמות הרכות בנפח גדול מובילים לליקויים תפקודיים ויכולים להשפיע מאוד על איכות החיים של המטופל. למרות שחזור כירורגי יכול להתבצע באמצעות העברת דש חופשית אוטולוגית או allotransplantation מרוכב כלי דם (VCA), שיטות כאלה יש גם חסרונות. בעיות כגון תחלואה באתר התורם וזמינות רקמות מגבילות את העברת הדשים החופשית האוטולוגית, בעוד שדיכוי חיסוני הוא מגבלה משמעותית של VCA. רקמות מהונדסות בניתוחים משחזרים בשיטות דה-סלולריזציה/רצלולריזציה מייצגות פתרון אפשרי. רקמות שעברו דה-תאי נוצרות בשיטות המסירות חומר תאי מקומי תוך שמירה על המיקרו-ארכיטקטורה של המטריצה החוץ-תאית הבסיסית (ECM). פיגומים תאיים אלה יכולים לאחר מכן להיות recellularized עם תאים ספציפיים לנמען.
פרוטוקול זה מפרט את שיטות הרכש והדה-סלוליזציה המשמשות להשגת פיגומים תאיים במודל חזיר. בנוסף, הוא מספק גם תיאור של תכנון והגדרת ביוריאקטור זליפה. הדשים כוללים את האומנטום החזירי, הטנזור fascia lata והאמה הרדיאלית. דה-סלוליזציה מתבצעת באמצעות פרפוזיה ex vivo של דטרגנט נתרן דודציל סולפט (SDS) בריכוז נמוך ולאחר מכן טיפול באנזים DNase ועיקור חומצה פראצטית בביוריאקטור פרפוזיה מותאם אישית.
דה-סלוליזציה מוצלחת של רקמות מאופיינת במראה לבן-אטום של דשים באופן מקרוסקופי. דשים תאיים מראים היעדר גרעינים על כתמים היסטולוגיים והפחתה משמעותית בתכולת הדנ”א. פרוטוקול זה יכול לשמש ביעילות ליצירת פיגומי רקמות רכות שעברו דה-תאי עם ECM משומר ומיקרו-ארכיטקטורה של כלי הדם. פיגומים כאלה יכולים לשמש במחקרי recellularization הבאים ויש להם פוטנציאל לתרגום קליני בניתוחים משחזרים.
פציעה טראומטית והסרת גידולים עלולים להוביל לפגמים גדולים ומורכבים ברקמות הרכות. פגמים אלה עלולים לפגוע באיכות החיים של המטופל, לגרום לאובדן תפקוד ולגרום לנכות קבועה. בעוד טכניקות כגון העברת דש רקמה אוטולוגית היו נהוגות בדרך כלל, בעיות עם זמינות דש ותחלואה באתר התורם הן מגבלות עיקריות 1,2,3. אלוטרנספלנטציה מרוכבת וסקולרית (VCA) היא חלופה מבטיחה המעבירה רקמות מרוכבות, למשל, שרירים, עור, כלי דם, כיחידה אחת למושתלים. עם זאת, VCA דורש דיכוי חיסוני ארוך טווח, מה שמוביל לרעילות תרופות, זיהומים אופורטוניסטיים וממאירויות 4,5,6.
פיגומים תאיים מהונדסים רקמות הם פתרון אפשרי למגבלות אלה7. ניתן להשיג פיגומים של רקמות תאיות באמצעות שיטות דה-סלולריזציה, המסירות חומר תאי מרקמות מקומיות תוך שמירה על המיקרו-ארכיטקטורה של המטריצה החוץ-תאית הבסיסית (ECM). בניגוד לשימוש בחומרים סינתטיים בהנדסת רקמות, השימוש בפיגומים שמקורם ביולוגי מציע מצע ECM ביומימטי המאפשר תאימות ביולוגית ופוטנציאל לתרגום קליני8. לאחר הדה-סלולריזציה, ה-recellularization הבא של פיגומים עם תאים ספציפיים לנמען יכול ליצור רקמות מתפקדות של כלי דם עם מעטמאוד אימונוגניות 9,10,11. על ידי פיתוח פרוטוקול יעיל להשגת רקמות תאיות באמצעות טכניקות דה-סלוליזציה של פרפוזיה, ניתן להנדס מגוון רחב של סוגי רקמות. בתורו, בנייה על טכניקה זו מאפשרת את היישום לרקמות מורכבות יותר. עד כה, דה-סלוליזציה של פרפוזיה של רקמות רכות וסקולריות נחקרה באמצעות רקמות וסקולריות פשוטות כגון דש פאסיו-עורי בעובי מלא במכרסם 12, חזיר13, ומודלים אנושיים 14, כמו גם שריר השלד של רקטוס אבדומיניס חזירי15. בנוסף, רקמות וסקולריות מורכבות עברו גם זלוף דה-תאי כפי שהוכח במודלים שלאוזן חזיר ואוזן אנושית 16,17 ובמודלים של השתלת פנים מלאות אנושיות 18.
כאן, הפרוטוקול מתאר את הדה-סלוליזציה של דשים חופשיים של כלי דם באמצעות פיגומי ECM שמקורם ביולוגית. אנו מציגים את הדה-סלוליזציה של שלושה דשים רלוונטיים מבחינה קלינית: 1) האומנטום, 2) הטנזור fascia lata, ו-3) האמה הרדיאלית, שכולם מייצגים את דשי סוסי העבודה המשמשים באופן שגרתי בניתוחי שחזור ולא נבדקו בעבר במחקרים בבעלי חיים בהקשר של דה-סלוליזציה של רקמות. דשים מהונדסים ביולוגית אלה מציעים פלטפורמה רב-תכליתית וזמינה בעלת פוטנציאל ליישומים קליניים לשימוש בתחום של תיקון ושחזור פגמים ברקמות רכות גדולות.
הפרוטוקול המוצע משתמש בזילוף של SDS בריכוז נמוך כדי לבצע דה-סלולריזציה של מגוון דשים שמקורם בחזירים. עם הליך זה, omentum acellular, tensor fascia lata, ואת דשי האמה רדיאלי ניתן decellularized בהצלחה באמצעות פרוטוקול המעדיף SDS ריכוז נמוך. ניסויי אופטימיזציה ראשוניים קבעו כי SDS בריכוז נמוך (0.05%) בין יומיים לחמישה ימים …
The authors have nothing to disclose.
ללא
0.2 µm pore Acrodisk Filter | VWR | CA28143-310 | |
0.9 % Sodium Chloride Solution (Normal Saline) | Baxter | JF7123 | |
20 L Polypropylene Carboy | Cole-Parmer | RK-62507-20 | |
3-0 Sofsilk Nonabsorbable Surgical Tie | Covidien | LS639 | |
3-way Stopcock | Cole-Parmer | UZ-30600-04 | |
Adson Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
Antibiotic-Antimycotic Solution, 100X | Wisent | 450-115-EL | |
Atropine Sulphate 15 mg/30ml | Rafter 8 Products | 238481 | |
BD Angiocath 20-Gauge | VWR | BD381134 | |
BD Angiocath 22-Gauge | VWR | BD381123 | |
BD Angiocath 24-Gauge | VWR | BD381112 | |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | DNAse Co-factor |
DNase I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit) | Invitrogen | P7589 | |
DPBS, 10X | Wisent | 311-415-CL | without Ca++/Mg++ |
Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools | 13008-12 | |
Heparin, 1000 I.U./mL | Leo Pharma A/S | 453811 | |
Ketamine Hydrochloride 5000 mg/50 ml | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 612316 | |
Ismatec Pump Tygon 3-Stop Tubing | Cole-Parmer | RK-96450-40 | Internal Diameter: 1.85 mm |
Ismatec REGLO 4-Channel Pump | Cole-Parmer | 78001-78 | |
Ismatec Tubing Cassettes | Cole-Parmer | RK-78016-98 | |
Isoflurane 99.9%, 250 ml | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2231929 | |
LB Agar Lennox | Bioshop Canada | LBL406.500 | Sterility testing agar plates |
Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | DNAse Co-factor |
Masterflex L/S 16 Tubing | Cole-Parmer | RK-96410-16 | |
Midazolam 50 mg/10 ml | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2242905 | |
Monopolar Cautery Pencil | Valleylab | E2100 | |
Normal Buffered Formalin, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
N°11 scalpel blade | Swann Morton | 303 | |
Papain from papaya latex | Sigma-Aldrich | P3125 | |
Peracetic Acid | Sigma-Aldrich | 269336 | |
Plastic Barbed Connector for 1/4" to 1/8" Tube ID | McMaster-Carr | 5117K61 | |
Plastic Barbed Tube 90° Elbow Connectors | McMaster-Carr | 5117K76 | |
Plastic Quick-Turn Tube Plugs | McMaster-Carr | 51525K143 | Male Luer |
Plastic Quick-Turn Tube Sockets | McMaster-Carr | 51525K293 | Female Luer |
Punch Biopsy Tool | Integra Miltex | 3332 | |
Potassium Chloride 40 mEq/20 ml | Hospira Healthcare Corporation | 37869 | |
Povidone-Iodine, 10% | Rougier | 833133 | |
Serological Pipet, 2mL | Fisher Science | 13-678-27D | |
Snap Lid Airtight Containers | SnapLock | 142-3941-4 | |
Sodium Dodecyl Sulfate Powder | Sigma-Aldrich | L4509 | |
Surgical Metal Ligation Clips, Small | Teleflex | 001200 | |
Stevens Tenotomy Scissors, 115 mm, straight | B. Braun | BC004R | |
TruWave Pressure Monitoring Set | Edwards Lifesciences | PX260 |